RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)，也稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR實驗需要追求一致性（穩(wěn)定性），不管RNA上樣量如何，反轉(zhuǎn)錄的效率都保持一致，確保cDNA的差異能夠真實反映mRNA的差異。在進(jìn)行RT反應(yīng)之前，考慮以下幾個方面，可以更好地進(jìn)行RT-PCR實驗。

一、增加反應(yīng)體系的靈敏度：

1. 分離高質(zhì)量RNA：

成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍/酸性酚的一步法。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品(如胰臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍體積的乙醇，室溫放置3-5分鐘，10,000×g離心5分鐘。

2. 使用無RNaseH活性(RNaseH-)的逆轉(zhuǎn)錄酶：

在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在第一鏈合成反應(yīng)中，在緩沖液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。

逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA轉(zhuǎn)化成cDNA。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內(nèi)源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復(fù)合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長度。因此消除或大大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。

SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶，RNaseH- 的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及thermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全長的cDNA。RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響。ThermoScript比AMV的靈敏性強(qiáng)得多。RT-PCR產(chǎn)物的大小受限于逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時。同MMLV相比，SuperScripⅡ顯著提高了長 RT-PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。RNaseH- 的逆轉(zhuǎn)錄酶同時增加了熱穩(wěn)定性，所以反應(yīng)可以在高于正常的37-42℃的溫度下進(jìn)行。在建議的合成條件下，使用oligo(dT)引物和10μCi的 [α-P]dCTP。第一鏈的總產(chǎn)量使用TCA沉淀法計算。全長cDNA使用在堿性瓊脂糖膠上將大小分類的條帶切除并計數(shù)的方法分析。

3. 提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度：

較高的保溫溫度有助于RNA二級結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。對于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。然而某些模板仍然會存在二級結(jié)構(gòu)，即使熱變性后也是如此。對這些困難模板的擴(kuò)增可以使用 ThermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，并將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)置于較高溫度下進(jìn)行以改善擴(kuò)增。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當(dāng)使用基因特異性引物(GSP)進(jìn)行cDNA合成時(見第三章)。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預(yù)計的保溫溫度相同。不要在高于60℃時使用oligo(dT)和隨機(jī)引物。隨機(jī)引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。除了使用較高的逆轉(zhuǎn)錄溫度外，還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉(zhuǎn)到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，并加入預(yù)熱的2×的反應(yīng)混合物提高特異性(cDNA熱啟動合成)。這種方法有助于防止較低溫度時所發(fā)生的分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化 RT-PCR所需的多種溫度切換。

Tth熱穩(wěn)定聚合酶在Mg2+存在條件下作為DNA聚合酶，在Mn2+存在條件下作為RNA聚合酶。它可以在最高65℃條件下保溫。然而，PCR過程中Mn2+的存在會降低忠實性，這使得Tth 聚合酶不太適合用于高精確度的擴(kuò)增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆轉(zhuǎn)錄效率較低，這會降低靈敏度，而且，既然單個酶就可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR，那么沒有逆轉(zhuǎn)錄的對照反應(yīng)就不能用來將cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物同污染的基因組DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)分開來。

4. 促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄的添加劑：

包括甘油和DMSO在內(nèi)的添加劑加到第一鏈合成反應(yīng)中，可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開RNA二級結(jié)構(gòu)，最多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。為了在SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中最大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10%的甘油并在45℃保溫。如果1/10的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物加入到PCR中，那甘油在擴(kuò)增反應(yīng)中的濃度為0.4%，這不足以抑制PCR。

5. RNaseH處理：

在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應(yīng)可以提高靈敏度。對于某些模板，據(jù)認(rèn)為cDNA合成反應(yīng)中的RNA會阻止擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當(dāng)擴(kuò)增較長的全長cDNA目標(biāo)模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡ。對這種困難模板，RNaseH的處理加強(qiáng)了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號。對于多數(shù)RT-PCR反應(yīng)，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復(fù)合物中的RNA水解掉。

6. 小量RNA檢測方法的提高：

當(dāng)僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰(zhàn)性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量。可以在加入Trizol的同時加入無RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨后的沉淀。對于小于50mg的組織或106個培養(yǎng)細(xì)胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。

在使用SuperScriptⅡ的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入乙酰化BSA可以增加靈敏度，而且對于小量RNA，減少SuperScriptⅡ的量并加入40單位的 RnaseOut核酸酶抑制劑可以提高檢測的水平。如果在RNA分離過程中使用了糖元，仍然建議在使用SuperScriptⅡ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時加入 BSA或RNase抑制劑。

二、增加RT-PCR特異性

1. CNDA合成：

第一鏈cDNA合成的起始可以使用三種不同的方法，各種方法的相對特異性影響了所合成cDNA的量和種類。

隨機(jī)引物法是三種方法中特異性低的。引物在整個轉(zhuǎn)錄本的多個位點退火，產(chǎn)生短的，部分長度的cDNA。這種方法經(jīng)常用于獲取5'末端序列及從帶有二級結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。為了獲得最長的cDNA，需要按經(jīng)驗確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機(jī)引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應(yīng)體系。因為使用隨機(jī)引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA，所以模板一般選用 poly(A)+RNA。

Oligo(dT)起始比隨機(jī)引物特異性高。它同大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA 3'端所發(fā)現(xiàn)的poly(A)尾雜交。因為poly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2%，所以與使用隨機(jī)引物相比，cDNA 的數(shù)量和復(fù)雜度要少得多。因為其較高的特異性，oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進(jìn)行優(yōu)化。建議每20μl反應(yīng)體系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18適用于多數(shù)RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因為其熱穩(wěn)定性較好，適用于較高的保溫溫度。

基因特異性引物(GSP)對于逆轉(zhuǎn)錄步驟是特異性好的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機(jī)引物或 oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用于設(shè)計PCR引物的規(guī)則同樣適用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)GSP的設(shè)計。GSP可以同與mRNA3'最末端退火的擴(kuò)增引物序列相同，或GSP可以設(shè)計為與反向擴(kuò)增引物的下游退火。對于部分?jǐn)U增對象，為了成功進(jìn)行RT-PCR，需要設(shè)計多于一個反義引物，因為目的RNA的二級結(jié)構(gòu)可能會阻止引物結(jié)合。建議在20μl的第一鏈合成反應(yīng)體系中使用1pmol 反義GSP。

2. 提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度：

為了充分利用GSP特異性的全部優(yōu)點，應(yīng)該使用有較高熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶。熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶可以在較高溫度保溫以增加反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)性。比如，如果一個GSP退火溫度為55℃，那么如果使用AMV或M-MLV在低嚴(yán)謹(jǐn)性的37℃進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，GSP所帶有的特異性就沒有全利用。然而SuperScripⅡ和 ThermoScript可以在50℃或更高進(jìn)行反應(yīng)，這就會消除較低溫度時產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物。為獲得最大的特異性，可以將RNA/引物混合物直接從 65℃變性溫度轉(zhuǎn)移到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，并加入預(yù)熱的2×反應(yīng)混合液(cDNA合成熱啟動)。這有助于防止低溫時分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化 RT-PCR所需的多種溫度轉(zhuǎn)換。

3. 減少基因組DNA污染：

RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA分離方法，如Trizol Reagent，會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。為了避免產(chǎn)生于基因組DNA的產(chǎn)物，可以在逆轉(zhuǎn)錄之前使用擴(kuò)增級的DNaseⅠ對RNA進(jìn)行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子，防止高溫時所發(fā)生的依賴于鎂離子的RNA水解。

為了將擴(kuò)增的cDNA同沾染的基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物分開，可以設(shè)計分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產(chǎn)物會比來源于沾染的基因組DNA 的產(chǎn)物短。另外對每個RNA模板進(jìn)行一個無逆轉(zhuǎn)錄的對照實驗，以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉(zhuǎn)錄時所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。