脯氨酸脫氫酶試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

ProDH 是存在于線粒體內(nèi)的催化脯氨酸降解的關(guān)鍵酶。脯氨酸是分布*廣泛的一種滲透物質(zhì)，在脅迫條件下很多植物可以通過增加合成、減少降解而在體內(nèi)累積大量脯氨酸，降低 ProDH 活性對于調(diào)節(jié)滲透平衡、防止?jié)B透脅迫對植物造成傷害、清除自由基、保護細胞結(jié)構(gòu)具有重要意義。

測定原理：

利用異硫氰酸甲酯檢測 ProDH 催化的脫氫反應，600nm 處吸光值的吸光值的變化反映酶活性的高低。

組成：

試劑三臨用前加入 4ml 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑 4℃保存；試劑四臨用前加入 4ml 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑 4℃保存；

自備儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿，1500g 4℃離心 15min，取上清液于一支新的 EP 管中，加入一滴試劑一（用 10μl 的槍頭加入），渦旋混勻，冰浴放置 30min 后，16000g 4℃離心 20min，取上清置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 600nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1） 混合液的配制：首先將試劑三和試劑四配成溶液（見試劑的組成和配制），臨用前根據(jù)用量按照試劑二（V）：試劑三（V）：試劑四（V）=2.4（ml）：0.3（ml）：0.3（ml）的比例充分混勻。（注意：現(xiàn)配現(xiàn)用，用多少配多少），置于 30℃水浴 5min；

（2） 試劑五的配制：取試劑五一支，臨用前加入 500μl 蒸餾水充分溶解待用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 35μl 樣本、15μl 試劑五和 150μl 混合液，混勻，立即記錄

600nm 處初始吸光值A1 和 10min 后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

ProDH 活性計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每分鐘每 mg 組織蛋白在每ml 反應體系中使 600nm 處吸光值變化 0.01 為一個酶活力單位。

ProDH（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =57.14×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位定義：每分鐘每 g 組織在每ml 反應體系中使 600nm 處吸光值變化 0.01 為一個酶活力單位。

ProDH（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =57.14×ΔA÷W

V 反總：反應體系總體積，0.2ml； V 樣：加入樣本體積，0.035ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml； T：反應時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每分鐘每 mg 組織蛋白在每ml 反應體系中使 600nm 處吸光值變化 0.005 為一個酶活力單位。

ProDH（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.005÷T =114.29×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位定義：每分鐘每 g 組織在每ml 反應體系中使 600nm 處吸光值變化 0.005 為一個酶活力單位。

ProDH（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =114.29×ΔA÷W

V 反總：反應體系總體積，0.2ml；V 樣：加入樣本體積，0.035ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml； T：反應時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。