一、前言

動物細(xì)胞培養(yǎng)開始于本世紀(jì)初1962年，動物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模開始擴(kuò)大，發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法，利用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，動物細(xì)胞培養(yǎng)已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的生物制品已占世界生物高技術(shù)產(chǎn)品的50%。動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)制藥中非常重要的環(huán)節(jié)。目前，動物細(xì)胞有懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng).技術(shù)水平的提高主要集中在培養(yǎng)規(guī)模的進(jìn)一步擴(kuò)大、優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境、改變細(xì)胞特性、提高產(chǎn)品的產(chǎn)率與保證其質(zhì)量上。

二、動物細(xì)胞的特點(diǎn)及生長特性

動物細(xì)胞雖可像微生物細(xì)胞一樣，在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，但其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性與微生物細(xì)胞相比，有顯著差別：①動物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大得多，無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，對剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差；②倍增時間長，生長緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時須用抗生素；③培養(yǎng)過程需氧量少(氧傳質(zhì)系數(shù)KLa 大于10 h-1即可滿足每毫升107個細(xì)胞的生長)；④培養(yǎng)過程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在；⑤原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50 代即退化死亡；⑥代謝產(chǎn)物具有生物活性，生產(chǎn)成本高，但附加值也高。 
三、動物細(xì)胞的固定化培養(yǎng)技術(shù)

1、固定化培養(yǎng)方法

在動物細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)細(xì)胞的目的不僅僅要求催化活細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)細(xì)胞的目的不僅僅要求催化活力，更重要的是利用細(xì)胞來合成和分泌蛋白，因此如何保持細(xì)胞的活性顯得尤為重要。由于動物細(xì)胞的極度敏感性，上述這些固定化方法會對動物細(xì)胞產(chǎn)生毒性，另外多糖(如卡拉膠等) 由于具有很高的離子強(qiáng)度也會對細(xì)胞產(chǎn)生毒害，故在動物細(xì)胞培養(yǎng)中要考慮使用較溫和的固定化方法，如吸附、包埋、中空纖維或膠囊化。

（1）吸附

①多孔陶瓷

美國某公司開發(fā)了一種自動化的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)的核心是陶質(zhì)矩形蜂窩狀生物反應(yīng)器。反應(yīng)器構(gòu)型是一圓筒內(nèi)裝置有許多陶質(zhì)矩形通道的蜂窩狀圓柱體，可提供4. 25 m2 的生長表面積，既可用于培養(yǎng)懸浮生長的細(xì)胞，又可用于培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞。該系統(tǒng)可以連續(xù)化生產(chǎn)蛋白質(zhì)。由于產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中，給分離純化帶來方便。而且細(xì)胞不用從培養(yǎng)基中分離，所以不必考慮梯度問題；當(dāng)培養(yǎng)基高速循環(huán)時，可以保持相對恒定的營養(yǎng)物和氧濃度。增加套數(shù)即可實(shí)現(xiàn)放大。

②微載體

微載體細(xì)胞培養(yǎng)法是一種用于培養(yǎng)錨地依賴性細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。這種培養(yǎng)技術(shù)是在生物反應(yīng)器內(nèi)加入培養(yǎng)液和一種對細(xì)胞無毒害作用的材料支撐的顆粒 (微載體) ，使細(xì)胞在微載體表面附著和生長，并通過不斷攪拌使微載體保持懸浮狀態(tài)。培養(yǎng)液中大量的微載體為細(xì)胞提供了極大的附著表面，1g微載體其比表面積可達(dá) 6000cm2，從而可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。

微載體的直徑在60～250μm ，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由這些材料及其改良型制成的微載體主要參考了細(xì)胞的粘附特性，在其表面帶有大量電荷及其他生長基質(zhì)物質(zhì)，因而有利于細(xì)胞的粘附、鋪展和增殖。采用微載體培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn)： ①比表面積大，單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高；②采用均勻懸浮養(yǎng)，無營養(yǎng)物或產(chǎn)物梯度；③可用簡單顯微鏡觀察微載體表面的生長情況；④細(xì)胞收獲過程相對簡單，勞動強(qiáng)度小；⑤培養(yǎng)基利用率高，占地面積小；⑥放大容易，國外已有公司以1 000 L 規(guī)模培養(yǎng)人的二倍體細(xì)胞來生產(chǎn)β- 干擾素。但其缺點(diǎn)是攪拌槳及微珠間的碰撞易損傷細(xì)胞；接種密度高；微載體吸附力弱，不適合培養(yǎng)懸浮型細(xì)胞。

③大孔微載體

人們?yōu)榱私鉀Q微載體培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞易受機(jī)械損傷的缺陷以及能最大限度地擴(kuò)大比表面積，開發(fā)了具有連通溝回的大孔微載體。

大孔微載體將細(xì)胞固定在孔內(nèi)生長，因而與其他方法相比具有一系列優(yōu)點(diǎn)： ①比表面積大，是實(shí)心微載體的幾倍甚至幾十倍；②細(xì)胞在孔內(nèi)生長，受到保護(hù)，剪切損傷小；③與包埋法相比，傳質(zhì)尤其是傳氧效果好；④兩種類型細(xì)胞都適用；⑤細(xì)胞三維生長，細(xì)胞密度是實(shí)心微載體10倍以上，有的可108個/ mL；⑥適用于長期維持培養(yǎng)，細(xì)胞生長情況依然良好；⑦微載體濃度高，實(shí)心載體在培養(yǎng)液中濃度增大到一定時，細(xì)胞密度反而下降；而大孔微載體在濃度較高時，表面碰撞增加，能促使細(xì)胞在孔內(nèi)生長；⑧適合于蛋白質(zhì)生產(chǎn)和產(chǎn)物分泌。因此有人預(yù)言，大孔微載體質(zhì)生產(chǎn)和產(chǎn)物分泌。因此有人預(yù)言，大孔微載體技術(shù)將成為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的一種常用方式。

（2）包埋

將動物細(xì)胞包埋在各種多聚物多孔載體中而制成固定化動物細(xì)胞的方法稱為包埋法。此法步驟簡便，條件溫和，負(fù)荷量大，細(xì)胞泄露少。因細(xì)胞嵌入在高聚物網(wǎng)格中而受到保護(hù)，細(xì)胞能抗機(jī)械剪切。但該法也有一定缺點(diǎn)，如擴(kuò)散限制，并非所有細(xì)胞都處于最佳營養(yǎng)物濃度。包埋法一般適用于非錨地依賴型細(xì)胞的固定化。多孔凝膠是常用的載體，用于動物細(xì)胞固定化的凝膠主要有海藻酸鈣、瓊脂糖、血纖維蛋白等。

①海藻酸鈣凝膠

海藻酸鈣凝膠包埋法是將動物細(xì)胞與一定量的海藻酸鈉溶液混合均勻，然后滴到一定濃度的氯化鈣溶液中形成直徑約1mm內(nèi)含動物細(xì)胞的海藻酸鈣膠珠，分離洗滌后即可用于培養(yǎng)。此法操作時條件溫和，對活細(xì)胞損傷小。但固定后機(jī)械強(qiáng)度不高。為了大量制備海藻酸鈣凝膠包埋的固定化細(xì)胞，國外已有專門的振動噴嘴設(shè)備可供使用。

②瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠可用二相法制得。將含有細(xì)胞的瓊脂糖溶液分散到一個水不溶相中(如石蠟油) ，形成直徑0.2mm凝膠珠珠，移去石蠟油后，細(xì)胞即可進(jìn)行培養(yǎng)。同海藻鈣一樣，瓊脂糖更適于培養(yǎng)懸浮細(xì)胞。盡管凝膠珠形成過程很復(fù)雜，目前放大體積不超過20 L。但瓊脂糖凝膠無毒性，具有較大的空隙，可以允許大分子物質(zhì)自由擴(kuò)散，因此該法特別適用于蛋白產(chǎn)物的連續(xù)生產(chǎn)。有人曾用瓊脂糖包埋雜交瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體和白細(xì)胞介素。

③血纖維蛋白

將動物細(xì)胞與血纖維蛋白原混合，然后加入凝血酶。凝血酶將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性的血纖維蛋白，將動物細(xì)胞固定在其中。血纖維蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁，因此兩種類型的細(xì)胞都適于培養(yǎng)。而且基質(zhì)高度多孔，允許大分子物質(zhì)的自由擴(kuò)散。但機(jī)械強(qiáng)度差，對剪切力很敏感。

（3）中空纖維

中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用一種人工的“毛細(xì)管”即中空纖維給培養(yǎng)的細(xì)胞提供物質(zhì)代謝條件而建立的一種體外培養(yǎng)系統(tǒng)。

中空纖維培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是無剪切、高傳質(zhì)、營養(yǎng)成分的選擇性滲入，使培養(yǎng)細(xì)胞和產(chǎn)物密度都可達(dá)到比較高的水平。缺點(diǎn)是膜的污染和堵塞，觀察困難，細(xì)胞生長或過量氣體產(chǎn)生會破壞纖維。中空纖維培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展趨勢是讓細(xì)胞在管束外空間生長，以達(dá)到更高的細(xì)胞培養(yǎng)密度。目前中空纖維反應(yīng)器已進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞來生產(chǎn)單克隆抗體。

（4）微囊化

微囊化培養(yǎng)技術(shù)其要點(diǎn)是：在無菌條件下將擬培養(yǎng)的細(xì)胞、生物活性物質(zhì)及生長介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。生長介質(zhì)為1.4%海藻酸鈉溶液，半透膜由多聚賴氨酸形成。培養(yǎng)系統(tǒng)可采用攪拌式或氣升式反應(yīng)器系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)證明，采用批式和連續(xù)灌注式培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體，在7～27 d微囊內(nèi)抗體濃度可達(dá)1250～5300 mg/ L。利用微囊包裹具有特定功能的組織細(xì)胞，形成免疫隔離的人工細(xì)胞，以此植入疾病動物或病人體內(nèi)。1980 年報道了微囊化胰島移植治療大量實(shí)驗(yàn)性糖尿病。他們將同種大鼠胰島用海藻酸- 聚賴氨酸- 聚乙烯亞胺包埋后植入鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體內(nèi)，在未用免疫抑制劑的情況下，控制大鼠血糖正常達(dá)一年左右。

膠囊化培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是： ①可防止細(xì)胞在培養(yǎng)過程中受到物理損傷；②活性蛋白不能從囊中自由出入半透膜，從而提高細(xì)胞密度和產(chǎn)物含量，并方便分離純化處理。缺點(diǎn)是： ①微囊制作復(fù)雜，成功率不高；②微囊內(nèi)死亡的細(xì)胞會污染正常產(chǎn)物；③收集產(chǎn)物必須破壁，不能實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化。

2、固定化方法的選擇

 (1) 培養(yǎng)規(guī)模

 由于各種固定化系統(tǒng)可以獲得相同的細(xì)胞密度，且細(xì)胞的產(chǎn)率主要取決于細(xì)胞的擴(kuò)散，因此反應(yīng)器的體積是培養(yǎng)規(guī)模放大的主要決定因素。雖然微載體系統(tǒng)可以提供最大的單元操作，但其他系統(tǒng)也可以通過增加單元套數(shù)而獲得放大。

 (2) 培養(yǎng)方式

 除了海藻酸鈣包埋法外，其他固定化基質(zhì)都是多孔型的，能允許大分子物質(zhì)自由出入，因此可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的連續(xù)生產(chǎn)。在凝膠珠和微囊中可使蛋白產(chǎn)物積聚到很高的濃度，給后續(xù)的分離純化處理帶來方便，并大大降低了生產(chǎn)成本。

 (3) 所培養(yǎng)的細(xì)胞類型

 大多數(shù)固定化系統(tǒng)都適用于貼壁型細(xì)胞的培養(yǎng)。而在吸附非貼壁型細(xì)胞時，由于吸附力弱容易出現(xiàn)細(xì)胞泄露。

 (4) 制備方法的難易和成本

 由于固定化基質(zhì)是由制造商在不同的競爭時期提供的，因此各種固定化方法的成本很難比較。海藻酸鹽和瓊脂糖是以化學(xué)試劑形式出售；膠原珠是以無菌形式提供給使用者，以便于接種。

 3、固定化培養(yǎng)存在的問題

 (1) 固定化細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞密度較一般懸浮培養(yǎng)高10～100 倍，但同時也帶來了如何保證足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和氧的傳遞問題。

 (2) 細(xì)胞群體在大規(guī)模、長時間培養(yǎng)過程中分泌產(chǎn)物能力的丟失或產(chǎn)物活性的降低依然是細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域深感棘手的問題。包埋在凝膠或微囊中死亡的細(xì)胞會對其他細(xì)胞產(chǎn)生污染和毒害作用。

 (3) 培養(yǎng)基及固定化基質(zhì)價格昂貴，生產(chǎn)成本高居不下。尤其是高效的微載體細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)，銷售價格一直呈上漲趨勢。

 (4) 目前對細(xì)胞代謝和生長動力學(xué)的研究以及在線監(jiān)測水平還遠(yuǎn)不足以設(shè)計出確定的優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致昂貴培養(yǎng)基的浪費(fèi)。

 4、固定化動物細(xì)胞培養(yǎng)的展望

 固定化動物細(xì)胞培養(yǎng)工程發(fā)展的總方向是大型化、自動化、精巧化、低成本、高細(xì)胞密度、高目的產(chǎn)品產(chǎn)量。從國際上的發(fā)展趨勢看，動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要有：（1）開發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器和培養(yǎng)系統(tǒng)；(2) 開發(fā)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的載體；(3) 開發(fā)微囊技術(shù)；(4) 開發(fā)雜交、重組技術(shù)；(5) 開發(fā)無血清和化學(xué)合成的培養(yǎng)基；(6) 蛋白質(zhì)濃縮和提純技術(shù)。

 四、動物細(xì)胞的灌注培養(yǎng)技術(shù)

 動物細(xì)胞培養(yǎng)同傳統(tǒng)的微生物細(xì)胞培養(yǎng)相比，動物細(xì)胞培養(yǎng)存在著細(xì)胞倍增時間長、代謝途徑復(fù)雜、對營養(yǎng)的要求高、對外界環(huán)境如溫度、pH、溶氧、滲透壓、剪切力的敏感性強(qiáng)、細(xì)胞狀態(tài)容易改變等問題，大大增加了動物細(xì)胞培養(yǎng)的難度。如何完善細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，提高動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的產(chǎn)率，一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。

 1、灌注培養(yǎng)原理

 常用的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法有分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)，但產(chǎn)率一直不高。直到六十年代，灌注培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)，為動物細(xì)胞高密度大規(guī)模培養(yǎng)開辟了廣闊的前景。在隨后的三十年中，灌注培養(yǎng)技術(shù)得到了迅速地發(fā)展，已成為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法。

 在灌注培養(yǎng)中，細(xì)胞保留在反應(yīng)器系統(tǒng)中，收獲培養(yǎng)液的同時不斷地加入新鮮的培養(yǎng)基。灌注培養(yǎng)的主要優(yōu)點(diǎn)是連續(xù)灌注的培養(yǎng)基可以提供充分的營養(yǎng)成分，并可帶走代謝產(chǎn)物，同時，細(xì)胞保留在反應(yīng)器系統(tǒng)中，可以達(dá)到很高的細(xì)胞密度。同其他方法相比，灌注培養(yǎng)的產(chǎn)率可以提高一個數(shù)量級，并可大大降低勞動力消耗。

 灌注培養(yǎng)主要可分為兩大類：懸浮灌注培養(yǎng)和床層培養(yǎng)。懸浮灌注培養(yǎng)是在普通懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，加上一個細(xì)胞分離器而成，以微載體懸浮培養(yǎng)加旋轉(zhuǎn)過濾分離器最為常見。床層培養(yǎng)則把細(xì)胞直接保留于床層，不需要細(xì)胞分離器，其中堆積床和大孔載體培養(yǎng)的應(yīng)用較廣。

 2、灌注培養(yǎng)方法

 在灌注培養(yǎng)前，對動物細(xì)胞的生長和生理特性進(jìn)行充分的考察，是十分必要的，能為灌注培養(yǎng)提供有益的參考。以比生長速率為例，大量實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞的比生長速率降低時，產(chǎn)物的比生長速率提高，有人控制細(xì)胞的比生長速率為最大比生長速率的60%抗體生長速率增加了97%。灌注培養(yǎng)可以從兩個方面入手，一是改變動物細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境，實(shí)行階段培養(yǎng)；二是進(jìn)行代謝調(diào)控。

 （1）階段培養(yǎng)

 一般認(rèn)為，動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件應(yīng)盡量模擬來源動物體內(nèi)的條件，而且在培養(yǎng)中通常保持不變。而實(shí)際上，每種細(xì)胞的最適生長條件和最適產(chǎn)物生成條件是不同的。階段法培養(yǎng)就是根據(jù)這一點(diǎn)，把培養(yǎng)過程分為細(xì)胞生長期和產(chǎn)物生成期，分別采取不同的培養(yǎng)條件，以達(dá)到在細(xì)胞生長期使接種細(xì)胞大量繁殖，提高比生長速率，盡快獲得高密度細(xì)胞；在產(chǎn)物生成期保持細(xì)的高密度，維持存活率，降低細(xì)胞死亡速率，持續(xù)獲得高產(chǎn)率蛋白的目的。當(dāng)產(chǎn)物蛋白對細(xì)胞有抑制時，階段培養(yǎng)尤見優(yōu)勢。具體說來，可以用以下方法：

 ①pH值階段培養(yǎng)

 對大多數(shù)動物細(xì)胞，培養(yǎng)液中合適的pH為7.2-7.4。低于6.8或高于7.6對細(xì)胞的生長都不利。近年來，對胞內(nèi)pH的研究比較活躍。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)pH對細(xì)胞的代謝影響很大，胞內(nèi)pH 降低0.2個單位，就足以使磷酸果糖激酶失活，抑制糖酵解途徑，使細(xì)胞的生長受阻；而胞內(nèi)pH 升高0.2個單位，可以提高糖酵解速度50%。胞外pH 的降低和培養(yǎng)液中銨離子濃度的提高，都能引起胞漿酸化，胞內(nèi)pH降低。有人把CO2的濃度由5%降為2.5%，胞內(nèi)pH提高了0. 2個單位。胞內(nèi)pH比胞外pH的檢測麻煩，所以還沒有廣泛應(yīng)用。

 ②溶氧階段培養(yǎng)

 不同細(xì)胞和同一細(xì)胞在不同生長時期對氧的需求均不相同.有人發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長的最適溶氧值為60%，但有人發(fā)現(xiàn)雜交瘤的最適溶氧為100%。一般說來，溶氧主要影響細(xì)胞的繁殖，而對產(chǎn)物的生成無直接影響，通過影響細(xì)胞生長間接起作用。通常在細(xì)胞生長初期控制溶氧的較低的水平，在對數(shù)生長期，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到較高的濃度時，提高溶氧水平；在產(chǎn)物生成期，應(yīng)控制溶氧的適當(dāng)水平。溶氧過高，細(xì)胞就會加速消耗營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生許多代謝產(chǎn)物。這些代謝產(chǎn)物對細(xì)胞有抑制作用，會大大降低細(xì)胞的存活率，降低產(chǎn)物的比生成速率。溶氧過低，細(xì)胞過氧的需求得不到滿足，依然會降低產(chǎn)物蛋白的產(chǎn)物。

 ③化學(xué)試劑誘導(dǎo)階段培養(yǎng)

 如果構(gòu)建的細(xì)胞上有可誘導(dǎo)基因，進(jìn)入產(chǎn)物生成期后，就可以添加化學(xué)試劑對基因進(jìn)行誘導(dǎo)，以實(shí)現(xiàn)目的基因的高表達(dá)，比如，將表達(dá)尿激酶原和二氫葉酸還原酶基因的兩個轉(zhuǎn)錄單位置于同一載體，分別受金屬硫(MT)和SV40早期啟動子控制，具有用氨甲喋呤(MTX)使基因擴(kuò)增和利用金屬Zn2+誘導(dǎo)的雙重功能，有利于尿激酶的高表達(dá)。

 細(xì)胞在細(xì)胞周期的不同時期，不僅蛋白的分泌速率不同，而且所分泌蛋白的類型和糖基化程度也可能不同。因此，研究并控制細(xì)胞的生理狀態(tài)很重要。然而，在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞生理狀態(tài)的檢測很麻煩。有人發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞大小隨各時期變化很明顯，因此可以作電子細(xì)胞計數(shù)器就行了。分段培養(yǎng)應(yīng)結(jié)合具體的培養(yǎng)條件進(jìn)行。有些細(xì)胞的最適生長溫度和產(chǎn)物生成溫度相同，就不能進(jìn)行溫度階段培養(yǎng)，而應(yīng)尋找別的差異條件。在細(xì)胞生長期有的細(xì)胞可能會因比生長速率過大而產(chǎn)生非生產(chǎn)性細(xì)胞，這時就應(yīng)控制比生長速率在一個適當(dāng)?shù)姆秶?/p>

（2）代謝調(diào)控培養(yǎng)

 乳酸和氨是在培養(yǎng)過程中動物細(xì)胞產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物，對細(xì)胞的正常生理功能在抑制甚至毒害作用。在分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的這一問題尤為突出。盡管灌注培養(yǎng)可以通過提高灌注速度來去除抑制產(chǎn)物。但是，一方面由于灌注培養(yǎng)細(xì)胞濃度很高，提高灌注速率，營養(yǎng)成分的供給十分充分，氨和乳酸的產(chǎn)生速率也增加了。另一方面，過高的灌注速率提高了細(xì)胞的比生長速率，降低產(chǎn)物的比產(chǎn)率，加上細(xì)胞對營養(yǎng)的利用并不清晰，培養(yǎng)液中會殘留大量的蛋白，造成提取純化的不便和培養(yǎng)基的浪費(fèi)。所以，在培養(yǎng)中調(diào)控動物細(xì)胞的代謝途徑一直較受重視。通過代謝調(diào)控，可以減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生，降低細(xì)胞的死亡速率，還可以控制灌注速率和培養(yǎng)液成分，控制細(xì)胞的狀態(tài)和比生長速率，以提高目標(biāo)蛋白的產(chǎn)率。具體有以下方法：

 ①控制葡萄糖濃度法

 乳酸濃度升高，會導(dǎo)致比生長速率降低，比死亡速率升高。乳酸的降低可更換葡萄糖為己糖如果糖或半乳糖，還可限制葡萄糖減少乳酸的生成，使初始葡萄糖濃度較低，在培養(yǎng)過程中再添加。在控制葡萄糖濃度法培養(yǎng)中，生長期可以使葡萄糖濃度稍高，以促進(jìn)細(xì)胞生長；在產(chǎn)物合成期降低葡萄糖的濃度，降低乳酸的產(chǎn)生速率，避免乳酸的積累，減少毒害，降低死亡速率，維護(hù)持活細(xì)胞數(shù)在較高水平。同時還可以降低比生長速率，增加目標(biāo)蛋白的產(chǎn)生速率。

 灌注葡萄糖的同時，要間歇或連續(xù)地加入其他組分，以避免營養(yǎng)缺乏，其中谷氨酰胺要保持在較低水平，因?yàn)榧?xì)胞的生長不依賴糖酵解，即使沒有葡萄糖，細(xì)胞仍可以通過降解谷氨酰胺獲得能量。假如谷氨酰胺的濃度過高，細(xì)胞就會偏向谷氨酰胺酵解，從而削弱這種方法的效果。由于葡萄糖的價格相對低廉，這種方法很有前途。

 ②控制谷氨酰胺法

 上面提到，沒有葡萄糖，細(xì)胞可以利用谷氨酰胺作能量物質(zhì)。因此，控制谷氨酰胺比控制葡萄糖要容易些，應(yīng)用這一方法的報道也較多。控制谷氨酰胺濃度的目的，主要是減少氨的產(chǎn)生。氨對細(xì)胞的毒性比乳酸大得多，表現(xiàn)為降低比生長速率，增加死亡速率。有人詳細(xì)地研究了動物細(xì)胞的代謝過程，采用底物限制補(bǔ)料分批工藝對動物細(xì)胞進(jìn)行代謝控制。他采用這一方法，使氨的濃度降低了一半。控制谷氨酰胺法與控制葡萄糖法一樣，要維持葡萄糖在較低水平。

 ③控制葡萄糖和谷氨酰胺法

 在細(xì)胞中，葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝密切相關(guān)。葡萄糖消耗上升，則谷氨酰胺消耗下降，反之亦然。在相當(dāng)大的一個范圍內(nèi)，葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率與其濃度成正比。控制葡萄糖和谷氨酰胺法可降低乳酸和氨的產(chǎn)生，還能有效控制比生長速率。在細(xì)胞生長期，提供充分的營養(yǎng)，供細(xì)胞的需要；在產(chǎn)物合成期，降低葡萄糖和谷氨酰胺的濃度或流量，降低比生長速率，增加目標(biāo)蛋白的產(chǎn)率。

 ④去除代謝產(chǎn)物法

 通常使用透析膜，超濾臘或吸附劑選擇性去除乳酸、氨或銨離子。有人建議加化學(xué)試劑比如鉀鹽來消除氨的影響 ，也有人建議可使用有谷氨酰胺合成酶的細(xì)胞。

 3、灌注培養(yǎng)的缺點(diǎn)

 灌注培養(yǎng)發(fā)展到現(xiàn)在，還有許多急待解決的問題。其最大的缺點(diǎn)是培養(yǎng)基的利用不充分，造成一定的浪費(fèi)。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和產(chǎn)品分離技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，建立細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離的耦合系統(tǒng)(圖2) ，能充分利用培養(yǎng)液，降低生產(chǎn)成本，一直是人們追求的目標(biāo)，這里就不贅述。

 五、動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)

 動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)是生物科學(xué)領(lǐng)域中的重要研究課題之一。由于無血清培養(yǎng)基可以是采用已知分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型組分的低蛋白或無蛋白培養(yǎng)基。因而它不僅為研究和闡明細(xì)胞生長、增殖和分化的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了有力的工具，而且為現(xiàn)代生物技術(shù)，尤其是細(xì)胞工程的應(yīng)用準(zhǔn)備了更好的條件。下面就動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用現(xiàn)狀做一概述：

 1、動物細(xì)胞培養(yǎng)基的發(fā)展過程

（1）天然培養(yǎng)基階段

（2）合成培養(yǎng)基階段

（3）無血清培養(yǎng)階段

2、動物細(xì)胞培養(yǎng)中血清的作用

（1）提供有利于細(xì)胞生長增殖所需的激素、生長因子或提供合成培養(yǎng)基所缺乏的營養(yǎng)物質(zhì)。

（2）提供可識別金屬、激素、維生素和脂質(zhì)的結(jié)合蛋白，并通過與上述物質(zhì)的結(jié)合而起到穩(wěn)定和調(diào)節(jié)上述物質(zhì)的作用。此外結(jié)合蛋白還可消除某些毒素和金屬對細(xì)胞的毒性作用。

（3）提供貼壁細(xì)胞固著于適當(dāng)?shù)母街嫠璧馁N壁因子和擴(kuò)展因子。

（4）提供蛋白酶抑制劑，使細(xì)胞免受蛋白酶的損傷。

（5）提供  PH 緩沖物質(zhì)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH。

（6）影響培養(yǎng)系統(tǒng)中的某些物理特性如：剪切力、黏度、滲透壓和氣體傳遞速度等。

3、動物細(xì)胞培養(yǎng)中血清可能引發(fā)的問題：

（1）在一些基礎(chǔ)研究中，往往影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（2）血清中含有某些不利于細(xì)胞生長的毒性物質(zhì)或抑制物質(zhì)，對某些細(xì)胞的體外培養(yǎng)有去分化作用。

（3）血清中大量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)給疫苗、細(xì)胞因子、單克隆抗體等細(xì)胞產(chǎn)品的分離純化帶來很大困難。

4、無血清培養(yǎng)基的組成及其主要補(bǔ)充成分

（1）激素和生長因子

（2）結(jié)合蛋白

（3）貼壁因子和擴(kuò)展因子

（4）低分子量營養(yǎng)因子

5、無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)

（1）可避免血清批次間的質(zhì)量變動，提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。

（2）避免血清對細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染。

（3）避免血清組分對實(shí)驗(yàn)研究的影響。

（4）有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化。

（5）可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。

6、無血清培養(yǎng)基的缺點(diǎn)

主要表現(xiàn)為細(xì)胞的適用范圍窄，細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中易受某些機(jī)械因素和化學(xué)因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便。