氨基酸(amino acid, AA)含量測定試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

肝臟、腎臟是氨基酸代謝的主要器官，故尿中氨基酸的變化最能反應肝、腎的生理狀態。另外，氨基酸還能反應灼傷、傷寒等方面情況。植物體內氨基酸含量對研究植物在不同條件下及不同生長發育時期氮代謝變化、植物對氮素的吸收、運輸、同化及營養狀況等有重要意義。

測定原理：

氨基酸的α-氨基可與水合茚三酮反應，產生藍紫色化合物，在 570 nm 有特征吸收峰；通過測定 570 nm吸光度，來計算氨基酸含量。

組成：

試劑三臨用前加入 2 ml 無水乙醇，蓋緊后充分混勻，再加入 28ml 蒸餾水混勻，避光保存。試劑四臨用前加 5 ml 蒸餾水，充分溶解。

標準品臨用前加 10 ml 蒸餾水，充分溶解。1μmol/ml 標準液，4℃避光保存。

自備儀器和用品：

臺式離心機、可見分光光度計、水浴鍋、1ml 玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽、無水乙醇、冰和蒸餾水。

樣品中 AA 提取：

1、按照組織質量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進行室溫勻漿，然后轉移到 1.5 ml EP 管中，蓋緊后（防止水分散失）置于沸水浴提取 15 min；自來水冷卻后，8000g，4℃離心 10min，上清液置冰上待測。

2、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴ 個）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清等液體：直接檢測。

測定步驟：

1.   分光光度計預熱 30 min，調節波長到 570 nm，蒸餾水調零。

2.   空白管：取EP 管，加入 50μl 蒸餾水，500μl 試劑二，500μl 試劑三和 50μl 試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫 15 min，冷卻后反復顛倒EP 管數次，于 570nm 測定吸光值，記為A 空白管。顯色后務必在 30min 內測完。

3.   標準管：取EP 管，加入 50μl 標準品，500μl 試劑二，500μl 試劑三和 50μl 試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫 15 min，冷卻后反復顛倒EP 管數次，于 570nm 測定吸光值，記為A 標準管。顯色后務必在 30min 內測完。

4.   測定管：取EP 管，加入 50μl 上清液，500μl 試劑二，500μl 試劑三和 50μl 試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫 15 min，冷卻后反復顛倒EP 管數次，于 570nm 測定吸光值，記為A 測定管。顯色后務必在 30min 內測完。

注意：空白管和標準管只需要測定一次。

氨基酸含量計算公式：

（1） 按照樣本質量計算

氨基酸含量（μmol /g 鮮重）=[C 標準品×V 標準品×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]×（V樣總÷V 樣）÷W

=1×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管) ÷W

（2） 按照樣本蛋白濃度計算

氨基酸含量（μmol /mg prot）=[C 標準品×V 標準品×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]÷

（V 樣×Cpr）

=1×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管) ÷Cpr

（3） 按照細胞數量計算

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）=[C 標準品×V 標準品×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)] ×

（V 樣總÷V 樣×細胞數量）

=1×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管) ÷細胞數量

（4） 按照液體體積計算

氨基酸含量（μmol /ml）=[C 標準品×V 標準品×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]÷V 樣

=1×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)

C 標準品：標準品濃度，1μmol/ml；V 標準品：反應體系中加入標準品體積，0.05 ml；W：樣品質量， g；V 樣：反應體系中加入樣品提取液體積，0.05 ml；V 樣總：樣品提取液總體積，1ml，Cpr：樣本蛋白 濃度，mg/ml。

注意事項：

1.試劑盒中試劑三、試劑四和標準品均需臨用前配置，且避光保存，配置好未使用完的4℃保存且3天內使用完畢。

2. 為保證實驗結果的準確性，需先取 1-2 個樣做預實驗，如果測定的吸光值過高（高于 2.5），用蒸餾水稀釋后再測定。

3. 脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應在 570nm 處無吸收峰，因此，570nm 處測定結果不含這兩種氨基酸的量。

4.最  di 檢出限為 100μmol/L。