亮氨酸氨基肽酶（Leucine Aminopeptidase, LAP）

試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

LAP 是一類(lèi)能水解肽鏈N-末端為亮氨酸的酶，廣泛存在于肝、腎、胰等組織中，尤其以肝臟中含量最為豐富。各類(lèi)肝病患者因肝細(xì)胞損傷，血清LAP 的活性均有不同程度的升高，因此，血清 LAP 活性的檢測(cè)能從不同側(cè)面反映各種肝病的發(fā)生和發(fā)展。

測(cè)定原理：

LAP 分解L-亮氨酰對(duì)硝基苯胺生成對(duì)硝基苯胺，后者在 405nm 有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算LAP 活性。

組成：

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 1000~5000：1 的比例（建議 2000 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

LAP 測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 405nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑二轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解（如較難溶解，可 50℃水浴加熱約 30min 促進(jìn)溶解）；在 37℃

（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 250μl 樣本和 750μl 試劑一，混勻后立即記錄 405nm 處初始吸光值A1 和 2min 后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意事項(xiàng)：若ΔA 大于 0.5，需將酶液用提取液稀釋?zhuān)?jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。使 A2-A1 小于

0.5，可提高檢測(cè)靈敏度。

LAP 活力單位的計(jì)算：

1、血清（漿）LAP 活力的計(jì)算:

單位的定義：每ml 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol 的對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=205.8×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中LAP 活力的計(jì)算:

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=205.8×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.103×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：對(duì)硝基苯胺摩爾消光系數(shù)，9.72×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.25 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，2000 萬(wàn)。