| 熒光探針Fluo-3/AM和FuraRed測量單細胞中比率鈣 中國醫學物理學雜志1999年第3期第16卷實驗研究作者：馬曉冬朱曉亮趙 清張 瑾張 颯雷國華黃行許鮑永耀單位：馬曉冬趙 清張 瑾張 颯雷國華黃行許鮑永耀（*軍醫大學中心實驗室）；朱曉亮（南方醫院皮膚科,廣東廣州510515）關鍵詞：激光掃描共聚焦顯微鏡；Fluo-3/AM；FuraRed；比率鈣... 摘要：應用ACAS570激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM簡稱共焦顯微鏡）和鈣離子指示劑Fluo-3/AM 、FuraRed熒光探劑雙標記技術，測定了單個活細胞內比率鈣的動態變化。結果顯示37 ℃, Fluo-3/AM濃度10 μmol/L，FuraRed濃度10 μmol/L的條件下，昆明小鼠巨噬細胞負載1 h左右即可獲良好的標記效果。用比率探針測量細胞內Ca2+的動態變化，使Ca2+的定性定量測定不受染料濃度、細胞大小、照射光強度以及一定程度的光漂白和染料泄漏等因素的影響，提供了一種準確定性定量細胞內Ca2+的實時、動態、原位變化的新方法。 中圖分類號：Q74 文獻標識碼：A 文章編號：1005-202X（1999）03-0180－03 Ratiometric calcium measurements in single cells with visible wavelength probes fluo-3/AM and furared MA Xiao-donget al. First Military Medical University,Central Laboratory,, ZHU Xiao-liang Department of Dermatology of Nanfang Hospital , Guangzhou 510515,China Key words：laser scanning confocal microscope ; fluo-3/AM; furared; ratiometric calcium. 細胞內游離Ca2+不僅作為一種重要的第二信使廣泛參與細胞的運動、分泌、代謝和分化等多種細胞功能活動的調節[1]；而且胞內游離Ca2+濃度的變化與調控對于參與維持存在于細胞質膜或細胞器膜兩側的跨膜Ca2+梯差，介導細胞對外界刺激的應答反應具有重要的調節作用[2-4]。因此，在完整細胞上準確測定胞內游離Ca2+濃度的動態變化，其重要性是顯而易見的。本文利用ACAS570激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM），采用單激發單發射指示劑Fluo-3/AM和FuraRed雙標記法測定了外源性刺激劑地塞米松誘導胞漿游離Ca2+的動態變化，獲得了良好的測定效果。 1 材料與方法 1.1 材料 （1）試劑：①地塞米松，用不含Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制，RPMI1640培養基（Gibco， 德國），小牛血清（Gibco,德國）。②Fluo-3/AM（biotium公司） 、FuraRed（Molecular Probes Inc,USA）用二甲基亞砜配成1 mmol/L，置于-20℃冰箱保存，PluronicF-127（biotium公司）。③不含Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液（g/L）: 8.01 gNaCl、Na2HPO4.12H2O、0.23 g NaH2PO4.2H2O。④Hepes緩沖液。⑤昆明種雄性小鼠（*軍醫大學動物所提供）腹腔巨噬細胞培養。 （2）儀器：ACAS570激光掃描共聚焦顯微鏡（Meridian,USA） 1.2 方法 （1）巨噬細胞培養 18～20 g雄性昆明小鼠，按1次/天，1 ml/次連續三天腹腔注射1%巰基乙醇酸鈉，停一天，按鄂征等人的方法取腹腔巨噬細胞（臺酚蘭吞噬實驗顯示99％為巨噬細胞），以1×106個/ml接種于特制的Petri培養皿（Meridian，USA）,用含10％小牛血清的RPMI-1640培養于37℃，含5％CO2孵箱內。2 d后即可進行實驗。 （2）熒光探針標記 將培養2 d的小鼠腹腔巨噬細胞用Hepes緩沖液漂洗3次，滴入終濃度為10 μmol/L的Fluo-3/AM 和FuraRed，加入1 μl 25％ pluronic F-127，在37 ℃、5%CO2孵箱中孵育1 h，其間輕輕振蕩幾次，經Hepes緩沖液漂洗2次后，再滴入Hepes液0.5 ml。 （3）Ca2+動態變化的LSCM測定 LSCM由共聚焦顯微鏡主體，激光器（Ar+激光）和微型計算機構成。激光束的掃描與控制以及圖像數據的采集和加工均由計算機完成。將標記好熒光探劑Fluo-3/AM和FuraRed的小鼠腹腔巨噬細胞，放入激光掃描共聚焦顯微鏡測定小室，用裝有Olympus IMT-2倒置相差顯微鏡和40×物鏡ACAS570激光掃描共聚焦顯微鏡系統掃描成像。用488 nm氬離子激光同時激發兩種染料，用ACAS570多彩色濾光盤（Molti-Color Filter Wheel）提供的530/30 nm帶通濾光器和605 nm長通濾光器將兩者的發射光分開，用有增輝電路的DageCCD攝像機，以1.0秒的間隔記錄。數據通過圖像采集器直接送入計算機，然后用ACAS570-IQ分析軟件分析。 2 結果 （1）用外源性刺激劑地塞米松測得巨噬細胞中Fluo-3和FuraRed對細胞內Ca2+的熒光強度變化曲線。在本實驗中，將地塞米松（終濃度為1.5μM）加到巨噬細胞培養液中（100sec后），引起細胞內Ca2+迅速增加，隨后逐漸達到平臺。兩種染料的熒光強度動態變化曲線清楚的表明，加地塞米松時（100sec）引發Fluo-3熒光急劇增強，同時伴有FuraRed熒光減弱，提示Ca2+增加（圖1）。在加地塞米松前和Ca2+反應的峰值時，兩種染料的相對熒光強度以灰度圖表示（圖2）。 圖1 地塞米松刺激后，小鼠腹腔巨噬細胞負載Fluo-3/AM和FuraRed的熒光強度變化曲線檢測器1（Det1）Fluo-3/AM通過530/30nm帶能濾光器后單激發的熒光強度變化曲線檢測器2（Det2） FuraRed 通過605 nm長通濾光器后單激發的熒光強度變化曲線 （上圖） （下圖） 圖2 地塞米松處理前，小鼠腹腔巨噬細胞負載Fluo-3/AM、FuraRed的熒光灰度圖像（上圖）和處理后小鼠腹腔巨噬細胞負載Fluo-3/AM、FuraRed的熒光灰度圖像（下圖）。檢測器1（Detector1）表示負載Fluo-3/AM。檢測器2（Detector2）表示負載FuraRed。 （2）為了定量熒光變化，按實驗中每個時間點求得Fluo-3/AM探針發射強度與FuraRed探針發射強度的比率。巨噬細胞對地塞米松反應的動態變化曲線表明，熒光比率迅速增加1.2倍，隨后逐漸達到飽和狀態（圖3）。 圖3 地塞米松處理后，小鼠腹腔巨噬細胞負載 Fluo-3/AM、FuraRed的比率熒光動態變化曲線 3 討論 （1）在比率法中用兩種染料同時標記，需要其比率在細胞內Ca2+濃度不變時保持穩定。兩種染料的泄漏、區域化分布、漂白或代謝等均能導致實驗過程中比率不穩定。Fluo-3/AM和FuraRed都對光漂白敏感，對經過10 μmol/LFluo-3/AM和10 μmol/LFuraRed孵育的巨噬細胞連續掃描，在本實驗中地塞米松處理之前兩種染料熒光強度的基線值（圖1）及其比率熒光強度的基線值（圖3）都是穩定的。這些結果表明：巨噬細胞中染料無預先發生的光漂白或泄漏；Fluo-3/AM和FuraRed用在比率法中是可行的。 （2）FuraRed是近年來研制的一種*的Ca2+指示劑，發射640nm波長的熒光，熒光強度隨FuraRed與Ca2+結合的增加而減弱[5,6]。相反Fluo-3發射530nm較短波長的熒光，熒光強度隨Fluo-3/AM與Ca2+結合的增加而增強[7,8]。據此提供了一種定量細胞內Ca2+可見光激發的比率方法：將Fluo-3/AM和FuraRed聯合使用，用488nm的可見光（激光）激發，來測定細胞內比率Ca2+的實時、動態變化。由于這兩種染料與Ca2+結合發出的熒光量呈相反的變化，所以增加了對Ca2+檢測的靈敏度。 （3）Fluo-3/AM和FuraRed都是很好的Ca2+指示劑。聯合使用兩種指示劑，用單一可見光激發能為用比率法測量細胞內比率Ca2+提供一種*的有價值的方法。類似的比率測定法還有很多，如用兩種染料同時測量Ca2+和pH[5,9]。但這些方法需要兩種不同的熒光探針，而且須特別注意染料負載、光漂白和染料泄漏，每一種因素在各次實驗之間可能明顯地影響比率。使用Fluo-3/AM和FuraRed能提供一種Ca2+測量方法并具有可見光激發的優點。 參考文獻： [1] Capham D E. Cell, 1995，80: 259 . [2] Yang F Y, Tu Y P. Biochem Biophys Res Commun, 1991，175: 366. [3] Fan G F, Huang Y G, Bai Y H, et al. FEBS Lett, 1995，357: 13. [4] Yang X Y, Fan G F, Huang Y G, et al. Chin Sci Bull, 1996; 41: 338. [5] Haugland R P. （1992） Molecular probes Catalog. [6] Durebayashi N, Harkins A B, and Baylor S M. Biophysical J, 1992， 61: A160. [7] Minta A, Kao J P Y, and Tsien R Y. Biol Chem, 1989，264: 8171. [8] Kao J P Y, Harootunian A T, and Tsien R Y. Biol Chem, 1989，264: 817. [9] Rijkers G T , Justement L R, Griffeoen A W, and J. C. Cambier Cytometry, 1990，11: 923. |
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