Western Blot
工作原理
蛋白質(zhì)的電泳分離是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一,電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下,向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象.根據(jù)所采用的支持物不同,有瓊脂糖凝膠電泳,淀粉凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳等.其中,聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）由于無電滲作用,樣品用量少（1-100μg）,分辨率高,可檢出10-9-10-12mol的樣品,凝膠機(jī)械強(qiáng)度大,重復(fù)性好以及可以通過調(diào)節(jié)單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的應(yīng)用.
SDS-PAGE是zui常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式,特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量.
PAGE能有效的分離蛋白質(zhì),主要依據(jù)其分子量和電荷的差異,而SDS-PAGE（SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳）的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異,因?yàn)镾DS-PAGE的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中假如含有SDS和巰基乙醇（2-ME）或二巰基赤蘚醇（DTT）,其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵,破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu),SDS是一種陰離子表面活性劑即去污劑,它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵,破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu),并與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合,破壞其折疊結(jié)構(gòu),電泳樣品假如樣品緩沖液后,要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原劑巰基乙醇存在時(shí),蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被打開而不被氧化,蛋白質(zhì)也*變性和解聚,并形成榛狀結(jié)構(gòu),穩(wěn)定的存在于均一的溶液中,SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷,平均每兩個(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS分子,這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷*被SDS掩蓋,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其原來所帶的電荷,從而使蛋白質(zhì)原來所帶的電荷可以忽略不計(jì),消除了不同分子之間原有的電荷差別,其電泳遷移率主要取決于亞基分子質(zhì)量的大小,這樣分離出的譜帶也為蛋白質(zhì)的亞基.
樣品處理液中通常加入溴酚藍(lán)染料, 溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子,可以自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí),即可停止電泳.
另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加樣時(shí)樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部.
重要參數(shù)
①聚丙烯酰胺凝膠（PAG）制備原則:由于孔徑的大小取決于單體和雙體丙烯酰胺在凝膠中的總濃度（T）以及雙體占總濃度的百分含量即交聯(lián)度（C）決定的,因而制膠之前必須首先知道這兩個(gè)參數(shù).一般可以由下述公式計(jì)算:
T%=（a+b）/m*100%; 和 C%=a/（a+b）*100%
其中: a=雙體（bis）的重量 ;b=單體（arc）的重量 ;m=溶液的體積（ml）
②當(dāng)分析一個(gè)未知樣品時(shí),常常先用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)凝膠制成4-10的梯度凝膠進(jìn)行試驗(yàn),以便選擇理想的膠濃度.如果蛋白質(zhì)的分子量已知,可參考下表選擇所需凝膠濃度:
蛋白質(zhì)分子量范圍（Da） 適宜的凝膠濃度（%）
<104 20-30
1×104-4×104 15-20
4×104-1×105 10-15
1×105-5×105 5-10
>5×105 2-5
③分離膠:
電泳凝膠濃度
試劑 10% 12% 15% 10% 12% 15%
H2O（ml） 4.0 3.3 2.3 5.9 4.9 3.4
30%丙烯酰胺（T: 30%,C: 3%（ml） 3.3 4.0 5.0 5.0 6.0 7.5
1.5mol/lTris.cl（PH8.8） （ml） 2.5 2.5 2.5 3.8 3.8 3.8
10%SDS（ml） 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15
10%AP（ml） 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15
TEMED（μl） 4 4 4 6 6 6
總體積（ml） 10 15
④濃縮膠
試劑 濃度（5%）
H2O（ml） 4 2
30%丙烯酰胺（T: 30%,C: 3%（ml） 1 0.5
1.0mol/lTris.cl（PH8.8） （ml） 1 0.5
10%SDS（μl） 80 40
10%AP（μl） 60 30
TEMED（μl） 8 4
總體積（ml） 6 3
蛋白質(zhì)的樣品制備：
蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的*步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：
1：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的zui大溶解性和可重復(fù)性。
2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。
3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。
4：防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑）
5：樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80℃中保存，但要注意不要反復(fù)凍融。
一：準(zhǔn)備工作：
一個(gè)水浴箱，一臺(tái)超聲裝置，組織勻漿器
二：需要的溶液：
裂解液 Laemmli樣品緩沖液
三：操作步驟：
1）培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備：
1：胰酶酶解后裂解：
細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí)，以含0.05%胰蛋白酶消化，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450μl裂解液反復(fù)吹打。
2：皿上直接裂解：
細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí)，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，細(xì)胞刮刀收集，用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。
以上所得的樣品zui終用超聲細(xì)胞破碎儀超聲處理，超聲時(shí)為5S，間歇時(shí)間為10S，功率為100-120W至溶液清澈無粘稠為止，處理過程在水浴中進(jìn)行，后4℃25000g離心1小時(shí)取上清或以zui大強(qiáng)度超聲4次，每次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S，加入Laemmli 樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強(qiáng)力混勻，樣品置100℃水浴箱里水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取出清液，將其移入另一潔凈試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月）
2）組織樣品的制備：
手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中，漂洗數(shù)次，以清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個(gè)較小的組織塊放入機(jī)戒組織勻漿器中，按組織凈重，裂解液=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體方法見細(xì)胞培養(yǎng)的樣品制備，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當(dāng)?shù)纳蠘?buffer中，混勻后靜置3小時(shí)使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強(qiáng)力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。）
蛋白質(zhì)的樣品制備：
蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的*步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：
1：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的zui大溶解性和可重復(fù)性。
2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。
3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。
4：防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑）
5：樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80℃中保存，但要注意不要反復(fù)凍融。
一：準(zhǔn)備工作：
一個(gè)水浴箱，一臺(tái)超聲裝置，組織勻漿器
二：需要的溶液：
裂解液 Laemmli樣品緩沖液
三：操作步驟：
1）培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備：
1：胰酶酶解后裂解：
細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí)，以含0.05%胰蛋白酶消化，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450μl裂解液反復(fù)吹打。
2：皿上直接裂解：
細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí)，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，細(xì)胞刮刀收集，用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。
以上所得的樣品zui終用超聲細(xì)胞破碎儀超聲處理，超聲時(shí)為5S，間歇時(shí)間為10S，功率為100-120W至溶液清澈無粘稠為止，處理過程在水浴中進(jìn)行，后4℃25000g離心1小時(shí)取上清或以zui大強(qiáng)度超聲4次，每次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S，加入Laemmli 樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強(qiáng)力混勻，樣品置100℃水浴箱里水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取出清液，將其移入另一潔凈試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月）
2）組織樣品的制備：
手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中，漂洗數(shù)次，以清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個(gè)較小的組織塊放入機(jī)戒組織勻漿器中，按組織凈重，裂解液=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體方法見細(xì)胞培養(yǎng)的樣品制備，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當(dāng)?shù)纳蠘?buffer中，混勻后靜置3小時(shí)使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強(qiáng)力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。）
附：
一：裂解液的制備：
組織裂解液（全細(xì)胞蛋提取）：1：Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.4
2: Nacl 150 mmoL/L
3: 去氧膽酸鈉 0.25%
4：NP-40或Triton-x-100 1%
5: EDTA 1 mmoL/L
6： PMSF 1 mmoL/L
7： Aprotinin 1μg/ml
8: leupeptin 1μg/ml
9: pepstain 1μg/ml
其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。
細(xì)胞裂解液：1：NP-40裂解體系： 150 mmoL/L Nacl
1.0%NP-40或Triton-x-100
50 mmoL/L Tris（PH8.0）
2：RIPA裂解體系：150 mmoL/L Nacl
1.0%NP-40或Triton-x-100
0.5%脫氧膽酸鈉
0.1%SDS
50 mmoL/L Tris（ ph8.0）
二：Laemmli 樣品緩沖液配置（1*SDS樣品緩沖液）
50 mmoL/L Tris-HCL （PH8.0）
100 mmoL/L DTT
2% SDS
0.1% 溴酚藍(lán)
10% 甘油
此液可以配置成不同的儲(chǔ)存液，根據(jù)蛋白濃度而定，40C長期保存，用時(shí)臨時(shí)與蛋白液按比例混合，其中DTT應(yīng)臨時(shí)加入，以防降解。
蛋白質(zhì)定量
1）Bradford法:
檢測(cè)原理: Bradford與蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu),特殊氨基酸結(jié)合,由棕色變成藍(lán)色,595nm檢測(cè).該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較的,但不使用于小分子堿性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污劑的濃度超過0.2%影響測(cè)定結(jié)果,如TritonX-100,SDS,NP-40等.
①Bradford法濃染液的配制:將100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml濃磷酸;然后,用蒸餾水補(bǔ)充至200ml;此染液放4℃至少6個(gè)月保持穩(wěn)定.
②標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)樣本的制備:盡量使用與待測(cè)樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品,例如測(cè)定抗體,可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn),如果待測(cè)樣品是未知的,也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,通常在20μg -150μg/100μl之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.
③將待測(cè)樣本溶于100μl緩沖溶液中,該緩沖溶液相同（用PBS）
④按照1:5用水稀釋濃燃料結(jié)合溶液,如果出現(xiàn)沉淀,過濾除去.
⑤每個(gè)樣品家5ml稀釋的燃料結(jié)合溶液,作用5-30分鐘,燃料與蛋白結(jié)合,將由紅色變?yōu)樘m色,在595nm波長下測(cè)定其吸光度,注意顯色反應(yīng)不超過30分鐘.
⑥根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的濃度.
2）Lowry法:
檢測(cè)原理: 是Cu2+與蛋白作用生成的Cu+與雙縮脲試劑形成蘭色絡(luò)合物,菲林試劑增強(qiáng)蘭色形成,750nm檢測(cè).
①首先,將20g碳酸鈉溶于500ml水中;再將1g CuSO4.5H2O和2g酒石酸鈉溶于500ml蒸餾水中;將銅/酒石酸鈉溶液放在磁力攪拌器上攪拌緩緩加碳酸鈉溶液,儲(chǔ)存于冰箱中,可穩(wěn)定保存1年以上.
②Folin-ciocalteu酚試劑
③按體積比1:2:1將銅/酒石酸/碳酸鈉,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室溫下儲(chǔ)藏,可穩(wěn)定保存2周,標(biāo)明為試劑A
④按體積比1:5將Folin-ciocalteu酚試劑和H2O混合,室溫下儲(chǔ)存于琥珀色試劑瓶中,可穩(wěn)定保存1個(gè)月,表明為時(shí)機(jī)B
⑤用蒸餾水將樣本（5-100μg）稀釋為1ml,并準(zhǔn)備100,50,25,12.5μg /ml,4個(gè)濃度的BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.
⑥每個(gè)蛋白樣品家1.0ml試劑A,混合均勻,在室溫下孵育10分鐘.
⑦加入0.5 ml試劑B并立即混合, 在室溫下孵育30分鐘.
⑧在750nm光波長下測(cè)定吸光度;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本蛋白質(zhì)的濃度.
3）紫外分光光度法:
檢測(cè)原理:是因蛋白質(zhì)樣品在280nm波長下有zui大吸光率,zui大吸光率主要取決于酪氨酸和色氨酸的存在.
①純化蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定:在280nm波長下讀取與適當(dāng)對(duì)照相比較的吸光值.
②對(duì)于抗體和BSA,可按照下述標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算其濃度,對(duì)其他蛋白質(zhì)粗略地估計(jì):1單位吸光值相當(dāng)于1mg/ml
蛋白質(zhì) A280（1mg/ml）
IgG 1.35
IgM 1.2
BSA 0.7
③含有核苷酸的蛋白質(zhì)溶液濃度的測(cè)定:
蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=（1.55*A280）-（0.76*A260）
蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=A205（27+120A280/A205）
1）SDS-PAGE設(shè)備和材料
①電泳裝置（垂直板電泳槽）為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYCZ-24D型電泳裝置。
②電泳儀（電源）為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-8B型。
③振蕩器
2）試劑
①丙烯酰胺（電泳級(jí)）
②N,N′-甲叉雙丙烯酰胺（bis）
③SDS
④TEMED
⑤Tris
⑥過硫酸銨
⑦α-巰基乙醇或DTT
⑧甘油
⑨甘氨酸
⑩溴酚藍(lán)
（11）鹽酸
3）聚膠前準(zhǔn)備：
①配制凝膠儲(chǔ)液： T%=30% C%=1% arc:bis=29:1 過濾后4℃避光保存。
②配制濃縮膠緩沖液： 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 過濾后4℃避光保存。
③配制分離膠緩沖液： 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 過濾后4℃避光保存。
④配制10%SDS
⑤配制10%過硫酸銨（AP）
⑥TEMED原溶液
⑦電泳緩沖液（5×）：Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L,臨用時(shí)稀釋5倍至1×SDS電泳緩沖液加入電泳槽中。
4）制膠: 制膠關(guān)鍵是聚合時(shí)間,是分離膠聚合控制在分離膠從加入10%AP和TEMED起至開始出現(xiàn)凝膠的時(shí)間為15-20分鐘（并不是此時(shí)已凝聚*）。對(duì)濃縮膠*聚合速度為8-10min開始可見聚合，可以通過調(diào)節(jié)AP和TEMED的加入量來控制，因液體中含有分子氧可抑制凝膠的聚合，故用時(shí)可在真空中抽氣以排除液體中的分子氧，灌完分離膠后加水以封閉分離膠與外界氧氣的結(jié)合，總之，要掌握一個(gè)原則：即用盡量少的催化劑在*時(shí)間聚合。
①按比例配制分離膠，輕緩地?fù)u動(dòng)溶液（8-10下），使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注入一層水或正丁醇，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中，然后靜置90min。
②同前按比例配制濃縮膠，但搖動(dòng)溶液時(shí)不要過于劇烈以免引入過多地氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分，以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，靜制90min以上以保證*聚合。
5）預(yù)電泳： 將聚合好的凝膠安置于電泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽電泳緩沖液后低電壓短時(shí)間的預(yù)電泳（恒壓10-20V,20-30min），清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通。
6）加樣： 預(yù)電泳后依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和待分析樣品，注意加樣時(shí)間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散，為避免邊緣效應(yīng)，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。
7）電泳： 加樣完畢，蓋好電泳槽的蓋子并選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳，通常在連續(xù)系統(tǒng)中，上層濃縮膠的電泳電壓要低于分離膠的電泳電壓，使樣品更好的進(jìn)入凝膠，電泳時(shí)，應(yīng)采用恒壓的模式，這樣蛋白質(zhì)才可以保證恒定的電泳遷移率。一般采用恒壓濃縮膠80V，分離膠120V，電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。
8）染色和脫色
電泳完畢需通過染色和脫色評(píng)定其結(jié)果的優(yōu)劣.對(duì)凝膠中分離成不同條帶的蛋白進(jìn)行檢測(cè).此外,根據(jù)不同的研究目的,也可將凝膠電印跡
①考馬斯亮藍(lán)染色:
將凝膠取出放入培養(yǎng)皿中到如少量的染色液,以浸沒凝膠為宜,在搖床上震蕩,直到凝膠上出現(xiàn)明顯的條帶為止,一般5-6小時(shí)或者4℃過夜;然后傾去染色液，用脫色液洗滌震蕩,其間要不斷換脫色液,直至脫色液顏色稍清亮.,凝膠背景清楚為止.
②染色液配制:
90ml甲醇和H20混合溶液（甲醇:水=1:1,V/V）和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考馬斯亮藍(lán)R250用濾紙過濾染液以除去顆粒不溶性物質(zhì).
③脫色液的配制:
90mL（甲醇）:H20（1:1 V/V）和10ml冰乙酸溶液.
附：
一、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的選擇
凝膠電泳中一個(gè)關(guān)鍵的指示系統(tǒng)，即蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（Molecular Weight Marker），電泳的分離效率，轉(zhuǎn)膜效率以及電泳泳動(dòng)情況等，皆需通過蛋白標(biāo)準(zhǔn)品來顯示，目前普遍采用的幾種蛋白標(biāo)準(zhǔn)品有：
① Blue RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix
② Trichrom RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker
Mix
以上兩種Marker均為PIERCE公司的產(chǎn)品，貨號(hào)為：①prod# 26681; ②prod# 26691;該標(biāo)準(zhǔn)蛋白不需染色，在電泳凝膠中隨著蛋白質(zhì)的遷移，各種分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白逐漸分開，而顯示出非常漂亮的多色條帶，可通過電泳槽直接肉眼觀察各電泳帶的凝膠中的泳動(dòng)情況，當(dāng)相對(duì)于目的蛋白大小的標(biāo)準(zhǔn)蛋白與相鄰兩條標(biāo)準(zhǔn)蛋白達(dá)到所需分辨距離時(shí)，即可停止電泳，取出凝膠做進(jìn)一步的轉(zhuǎn)膜工作。
③ Chemiluminescent BlueRangerR peroxidase-Labled protein
Molecular Weight Marker Mix
以上也為PIERCE產(chǎn)品，貨號(hào)為：prod# 26651，該標(biāo)準(zhǔn)蛋白同上也具有以上作用外，同時(shí)在使用化學(xué)發(fā)光時(shí)，和樣品一起顯色經(jīng)膠片曝光后，在膠片上可出現(xiàn)漂亮的條帶。
④ Blotinylated SDS Molecular Weight Marker Mix
以上為Sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)為B2787,作用效果同③
二、對(duì)照的設(shè)置
一般需要設(shè)立:
內(nèi)參照, 提示系統(tǒng)的穩(wěn)定性,一般是一些管家蛋白
陽性對(duì)照, 即肯定可以表達(dá)你的目的蛋白的組織或者細(xì)胞,同時(shí)可以提示你一抗的質(zhì)量
陰性對(duì)照: 即肯定不會(huì)表達(dá)你的目的蛋白的組織或者細(xì)胞.在實(shí)驗(yàn)中
根據(jù)你的需要選擇
免疫印跡
蛋白質(zhì)印跡法是將蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)SDS-PAGE后,分離為不同條帶,其中含有能與特異性抗體（或McAb）相應(yīng)的待檢測(cè)的蛋白質(zhì)（抗原蛋白）,將PAGE膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到NC膜上此過程稱為blotting,以利于隨后的檢測(cè)能夠的進(jìn)行,隨后,將NC膜與抗血清一起孵育,使*抗體與待檢的抗原決定簇結(jié)合（特異大蛋白條帶）,再與酶標(biāo)的第二抗體反應(yīng),即檢測(cè)樣品的待測(cè)抗原并可對(duì)其定量.
一、 設(shè)備和材料
轉(zhuǎn)移電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳儀（電源）
震蕩器
冰箱
濾紙
NC膜
膠片
暗室
二、 試劑
封閉液:5%的脫脂牛奶粉TBS-T
*抗體（Ab1）
第二抗體（標(biāo)記的Ab2）
底物以及顯色指示劑
漂洗液（TBS-T）
轉(zhuǎn)印緩沖液
抗體稀釋液
麗春紅S
顯影液
定影液
三、 試劑的配制
封閉液: 5g的脫脂牛奶+100ml的TBS-T
漂洗液（TBS-T）: 0.01M TBS-T為Tris 1.21g+ NaCl5.84g+800ml H2O用HCl調(diào)節(jié)PH到7.5,假如0.05%或者0.1%Tween-20用H2O定溶至1000ml
轉(zhuǎn)印緩沖液: 同5×SDS電泳緩沖液,不含SDS,如果采用PVD干膜或NC膜加20%甲醇,不加甲醇也可以
Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1000ml,一般不需調(diào)節(jié)PH值 ,用時(shí)稀釋5倍到1×轉(zhuǎn)印緩沖液.
顯影液：H2O--750ml
米土爾--3g
無水亞硫酸鈉---100g
對(duì)苯二酚---3g
溴化鉀---3g
無水碳酸鈉：先加5gPH10.0不夠時(shí)再加5g
注：以上配定加H2o定容至1000ml
定影液：起始水溫：60℃ H2o 700ml
硫代硫酸鈉：240g
無水亞硫酸鈉：25g
冰醋酸：48ml
注：加H2o至1000ml
四、 電印跡
蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后，必須從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，固相支持物具有牢固結(jié)合蛋白又不影響蛋白質(zhì)Ag活性，而且支持物本身還有免疫反應(yīng)惰性等特點(diǎn)，常用的支持物有：硝酸纖維膜（NC膜）或PVDF膜。
蛋白質(zhì)從凝膠向膜轉(zhuǎn)移的過程普遍采用電轉(zhuǎn)印法，分為半干式和濕式轉(zhuǎn)印兩種模式。
一． 半干式電轉(zhuǎn)印
1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE結(jié)束后，取出凝膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。取凝膠方法：用刀片將兩玻璃板分開，將多余的凝膠劃去，上部以濃縮膠為準(zhǔn)全部棄去，下部以分子量標(biāo)準(zhǔn)zui小分子帶下一點(diǎn)全部劃去，取一10ml注射器注滿轉(zhuǎn)印緩沖液，插入玻璃板與凝膠之間注水，使水的壓力將兩者自然分開,邊推邊進(jìn),反復(fù)多次注水,直至凝膠從玻璃板上滑落下來。
2. 將NC膜和濾紙切出與凝膠一樣大小，置轉(zhuǎn)移緩沖液中濕潤5-10min.
3. 按照以下順序放置濾紙，凝膠和NC膜到半干槽中。
4. 每層之間的氣泡要全部去除。可以用10ml吸管輕輕在上一層滾動(dòng)去除氣泡，然后用*緣的塑料片中間挖空與凝膠一樣大小或略小一點(diǎn)，以防電流直接從沒有凝膠處通過造成短路，蓋好加上陽極電極板。
二．濕式電轉(zhuǎn)印
1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE結(jié)束后，取出凝膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。取出凝膠方法同半干式電轉(zhuǎn)印。
2. 打開電轉(zhuǎn)印夾，每側(cè)墊上一塊的用轉(zhuǎn)印液浸泡透的海面墊，再各放一塊轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙，濾紙與海面墊大小相同或與NC膜，凝膠大小相同均可，將凝膠平放在陰極側(cè)濾紙上，zui后將NC膜平放在凝膠上，去除氣泡，夾好電轉(zhuǎn)印夾。
3. 電泳槽加滿電轉(zhuǎn)印液，插入電轉(zhuǎn)印夾，將電泳槽放入冰箱內(nèi)（電轉(zhuǎn)印液之前要放入冰箱內(nèi)預(yù)冷），連接好電極，接通電流，轉(zhuǎn)印夾的NC膜應(yīng)對(duì)電泳槽的正極。
五、印跡膜上總蛋白的染色
在確定印跡中是否存在總蛋白之前,通過對(duì)硝酸纖維素膜染色可以了解轉(zhuǎn)印至膜上的總蛋白質(zhì)的組成情況,并可確定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記物的位置和確定轉(zhuǎn)印成功,同時(shí),該方法也清楚地顯示出轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的復(fù)雜性.
麗春紅S印跡膜染色法：
麗春紅S適用于酸性水溶液,染色但是不持久,在后續(xù)的處理中紅色染料易被洗去,由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合是可逆性的,該染色方法適用于所有顯示抗原的餓技術(shù), 麗春紅S帶負(fù)電荷,可以與帶正電賀的氨基酸殘基結(jié)合,同時(shí)麗春紅也可以與蛋白的非極性區(qū)相結(jié)合,從而形成紅色條帶.
1）麗春紅溶液的配制:
儲(chǔ)存液（10×）： 0.1g麗春紅溶于5ml冰乙酸,加入H2O定容至100ml,臨用前稀釋10倍為應(yīng)用液.
2）操作步驟
①轉(zhuǎn)印結(jié)束后取出印跡膜至于麗春紅S應(yīng)用液中,并在室溫下攪動(dòng)5-10分鐘
②將膜放入PBS洗數(shù)次,每次1-2分鐘,并且更換PBS
③根據(jù)需要將轉(zhuǎn)印部位和分子量標(biāo)準(zhǔn)位置進(jìn)行標(biāo)記
至此膜可以用于封閉和加入抗體
六、膜的封閉
在進(jìn)行抗體雜交之前，需要先對(duì)轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。封閉一般采用異源性蛋白質(zhì)或去污劑，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，10%馬血清以及5% No-fat milk等，至于選擇哪一類封閉液，首先應(yīng)考慮與檢測(cè)試劑相適應(yīng)，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用檢測(cè)試劑，就不能用全血清封閉，其次是盡可能使非特異著色背靜淺，封閉液以20%BSA效果較好，其次是5%N-fat milk.
封閉過程：
1） 洗轉(zhuǎn)印膜：室溫漂洗3次x10min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。
2） 取漂洗的轉(zhuǎn)印膜，放入5% No-fat milk的封閉液內(nèi)，搖床震動(dòng)，室溫封閉2h，也可在4度過夜。
3） 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次x10min.
七、抗體雜交
抗體表面主要采用間接法。即先加入未標(biāo)記特異性抗體（Ab1）與膜上抗原結(jié)合，再加入標(biāo)記的抗抗體（Ab2）進(jìn)行雜交檢測(cè)，標(biāo)記Ab2 物質(zhì)有放射性核素，酶，以及生物素等。
雜交過程：
１）封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入抗體稀釋液稀釋的Ab1濃度為1ug/ml，封口，4℃孵育過夜或室溫（22-25℃）搖動(dòng)孵育2h.
２） 液洗膜3次x10min
３）標(biāo)記的Ab2（羊抗兔-HRP）室溫1h，洗膜3x10min
八、檢測(cè)
根據(jù)標(biāo)記Ab2的標(biāo)記物不同,其雜交的結(jié)果檢測(cè)方法也不同,較常用的檢測(cè)系統(tǒng)有HRP標(biāo)記 Ab2的的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）和DAB檢測(cè)系統(tǒng).
1） 辣根過氧化物酶-DAB法:
①DAB顯色液的配制:按照1mlH2O加顯色劑A,B,C各1滴,混勻.
②顯色:將適量DAB顯色液平鋪在Ab2雜交后的印跡膜上,室溫放置觀察,可出現(xiàn)明顯的棕褐色蛋白顯色帶
③終止:用Tris-HCl緩沖液或水漂洗雜交膜即可終止反應(yīng).
2） 辣根過氧化物酶-ECL法:
增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)是利用辣根過氧化物酶催化化學(xué)發(fā)光物質(zhì),生成一種不穩(wěn)定的中間物質(zhì),其衰變時(shí)在暗室內(nèi)形成明顯的肉眼可見的化學(xué)發(fā)光帶,利用X線膠片感光原理,將結(jié)果記錄下來:
ECM顯色劑配制:按mlH2O加顯色劑A、B各1滴,混勻.
在暗室將雜交后印跡膜放入顯色盒中,加上混合好的顯色液,月1-5分鐘
用紙巾吸去印跡膜邊緣或者邊角部分多余的顯色液,將一透明的玻璃紙蓋住撫平,并確定干的表面與膠片接觸.
將印跡膜在暗室中使膠片暴光1-5分鐘,沖洗膠片以確定所測(cè)抗原的正確暴光時(shí)間,暴光時(shí)間可短至幾秒也可以長到數(shù)小時(shí).
沖洗膠片步驟:先在顯影液中沖洗至膠片上出現(xiàn)條帶或者膠片透明為止,在放入定影液中漂洗,十秒即可.
注意事項(xiàng):
1. 免疫印跡雜交的敏感與檢測(cè)系統(tǒng)有關(guān).因此,凝膠電泳時(shí)的蛋白上樣量應(yīng)該保證被檢測(cè)抗原量不至于太低,如果過低應(yīng)該重新純化和濃縮使用,或者建議做一次梯度稀釋,上樣電泳后,直接考馬斯亮藍(lán)染色選擇*上樣量,純化和濃縮的蛋白質(zhì)樣品必須注意鹽的濃度過高,可平衡一下鹽的濃度,如,透析.
2. 形成凝膠的試劑要有足夠的純度,激活劑的濃度適當(dāng),不僅可以決定凝膠聚合的速度,也將影響凝膠的質(zhì)量,聚膠時(shí)的溫度也將影響凝膠聚合的速度.因此,建議要根據(jù)不同溫度下適量增減激活劑的用量以保證分離膠從加入激活劑起至開始出現(xiàn)凝膠凝聚的時(shí)間為15-20分鐘*,對(duì)于濃縮膠*聚合時(shí)間為8-10分鐘開始可見聚合.灌完分離膠加水封閉分離膠與外界氧氣的結(jié)合.
3. 未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性,操作時(shí)應(yīng)該戴手套防護(hù).梳子插入濃縮膠時(shí),應(yīng)確保沒有氣泡,可將梳子稍微傾斜插入以減少氣泡的產(chǎn)生,梳子拔出來時(shí)應(yīng)該小心,不要破壞加樣孔,如有加樣孔上的凝膠歪斜可用枕頭插入加樣孔中糾正但要避免枕頭刺入膠內(nèi).
4. 電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺,同時(shí)建議低電壓短時(shí)間的預(yù)電泳,清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì),疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通（恒壓10-20V,20-30min）
5. 加樣前樣品應(yīng)先離心,尤其是長時(shí)間放置的樣品,以減少蛋白質(zhì)帶的拖尾現(xiàn)象
6. 為避免邊緣效應(yīng),可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液
7. 樣品緩沖液中煮沸的樣品可在-20℃存放數(shù),,但是反復(fù)凍融會(huì)使蛋白質(zhì)降解
8. 為減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散,上樣后應(yīng)盡快進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后也應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印.
9. 上樣時(shí),小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔
10. 取出凝膠后應(yīng)注意分清上下,可用刀片切去凝膠的一角作為標(biāo)記（如左上角）轉(zhuǎn)膜時(shí)也應(yīng)用同樣的方法對(duì)NC膜做上標(biāo)記（如左上角）以分清正反面和上下關(guān)系.
11. 轉(zhuǎn)膜時(shí)應(yīng)依次放好NC膜與凝膠所對(duì)應(yīng)的電極,即凝膠對(duì)應(yīng)負(fù)極,NC膜對(duì)應(yīng)正極.
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