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細(xì)胞凋亡在許多細(xì)胞系統(tǒng)中是一種被充分證實(shí)的現(xiàn)象它在胚胎發(fā)生期間的組織和器官發(fā)育以及調(diào)節(jié)成體組織的細(xì)胞更新中起關(guān)鍵作用。在免疫系統(tǒng)中，凋亡提供了胸腺自身反應(yīng)性T細(xì)胞2、生發(fā)中心低反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞3以及易受細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞攻擊的靶細(xì)胞的缺失機(jī)制。1,4在結(jié)構(gòu)上，細(xì)胞凋亡的特征是染色質(zhì)凝聚、細(xì)胞大小減小和核酸內(nèi)切酶將DNA切割成核小體大小的片段。1,4,5除了這些細(xì)胞形態(tài)的變化發(fā)生在細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞膜磷脂不對稱性的喪失是一個(gè)重要的事件，磷脂酰絲氨酸(PS)從磷脂雙分子層的內(nèi)小葉轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面雖然PS外化的功能尚不清楚，但它可能是吞噬細(xì)胞識別的“信號"，吞噬細(xì)胞通過吞噬凋亡細(xì)胞作出反應(yīng)。

在失去質(zhì)膜完整性之前。暴露于細(xì)胞表面的PS為檢測細(xì)胞凋亡提供了一種簡單的方法。膜聯(lián)蛋白V (Mr 36-kDa)是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白膜聯(lián)蛋白家族的一員，對含ps的磷脂雙分子層具有高親和力。當(dāng)PS暴露在細(xì)胞膜的細(xì)胞外表面時(shí)，膜聯(lián)蛋白V以大約7納米的親和力結(jié)合膜聯(lián)蛋白V的熒光染料偶聯(lián)物可用于監(jiān)測細(xì)胞膜磷脂不對稱性的變化10-13，從而提供了一種方便的工具。

由于PS外化發(fā)生的時(shí)間早于與凋亡相關(guān)的細(xì)胞核變化，因此ApoScreen Annexin V凋亡試劑盒可用于比基于dna的檢測更早地檢測凋亡途徑中的細(xì)胞標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V也可用于分析膜的變化，行星和紅細(xì)胞的不對稱單個(gè)ApoScreen標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V試劑見產(chǎn)品號10040-02和10040-09。

試驗(yàn)原理

ApoScreen Annexin V凋亡試劑盒采用r -植物紅蛋白標(biāo)記的Annexin V (Annexin V- r - pe)7-AAD評估細(xì)胞凋亡亞群。在細(xì)胞凋亡的早期階段，細(xì)胞開始在外細(xì)胞膜上顯示PS，通過膜聯(lián)蛋白V-R-PE染色細(xì)胞很容易檢測到PS。隨著在細(xì)胞凋亡的后期，質(zhì)膜變得越來越通透，7-AAD可以很容易地穿過細(xì)胞膜并與細(xì)胞DNA結(jié)合，為識別那些通過壞死等機(jī)制失去膜完整性的細(xì)胞提供了一種手段。當(dāng)細(xì)胞被膜聯(lián)蛋白V-R-PE和7-AAD雙重染色時(shí)，可以觀察到三種不同的細(xì)胞群(圖2):(i)活細(xì)胞不被膜聯(lián)蛋白VR-PE或7-AAD染色;(ii)兩種試劑染色的壞死細(xì)胞;(iii)僅膜聯(lián)蛋白V-R-PE染色的凋亡細(xì)胞。分析可以在任何配備單個(gè)激光的流式細(xì)胞儀上進(jìn)行，激發(fā)波長為488nm。

設(shè)備組件

1ml annexin V-R-PE:保存在2-8°C。按指示使用;無需預(yù)稀釋。

1 mL 7-AAD(100次):保存在2-8°C。按指示使用;無需預(yù)稀釋。避免皮膚接觸并妥善處理。

7 × 1.5 mL 10X結(jié)合緩沖液:保存在2-8°C。使用前用9份dH20稀釋1份10X緩沖液。