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三磷酸循環系列試劑盒 一管式點突變試劑盒
One-Stop Point mutation Kit

產品及特點
    基因的定點突變是重要的分子生物學技術，廣泛用于載體構建、基因改造、蛋白質功能研
究等領域。但傳統的方法需要使用單鏈 DNA 模板，而得到單鏈 DNA 模板又需要先將基因克
隆到類似 M13 這種載體中，操作過程冗長。為了克服這些缺點，本公司將突變位點設計到一
對互補的引物中，用高保真擴增質粒模板，然后用 Dpn I 去除原始的甲基化模板，新合成的
DNA 通過互補形成帶切口的雙鏈質粒，直接用于轉化感受態細菌。本方法過程示意圖如下：

本產品具有下列特點：
    1. 直接使用質粒 DNA 作為模板，免去了制備單鏈 DNA 的步驟。
    2. 基于高保真 PCR，對模板 DNA 序列沒特殊要求，可以用于突變任何序列。同時對模板的需求量很少。
    3. 一管式，全部在一個優化的緩沖體系中完成，非常簡單。
    4. 使用 Dpn I 去除未突變模板，突變效率高達 90%。
    5. 可用于制備點突變，缺失突變和插入突變。
    6. 本產品 A 型適用于 8 kb 一下，B 型適用于 8-15 kb。

規格及成分

成 份  　　　            A 型10次包裝　　　   B型10次包裝
高保真酶A型                  10 uL  　　　　　　  　無
高保真酶B型                  無  　　　　　         10 uL
5×高保真酶 Buffer A 型     100 uL                 無
5×高保真酶 Buffer B 型     無                     100 uL
dNTP（2.5 mM each）         50 uL                  50 uL
Dpn I 酶                      10 uL                  10 uL
超純水                        1 mL                   1 mL
使用手冊                      1 份                   1 份
運輸及保存　低溫運輸、-20℃保存, 有效期一年。
自備試劑　  質粒 DNA、突變引物、細菌轉化試劑

使用方法
一、 引物設計及注意事項
    用于特定基因突變的引物必須用戶單獨設計，請參考如下一些基本原則進行設計。
    1. 共需設計兩條*互補的一對引物， 它們覆蓋要擴增的突變區位點， 突變位點好放在引物的中心?？梢韵燃性O計一條，然后就可得互補的另一條引物。
    2. 引物的長度通常為 25-45 個堿基。引物中突變位點任何一側都必需滿足 Tm 大于45 的條件，Tm 計算方式為 Tm=4×(GC 堿基數)＋2×(AT 堿基數)。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就達到此標準，它的突變位點 AAG 所放位置使左側 Tm＝46；右側 Tm＝48，均大于 45。
    3. 盡量把引物的 GC 含量控制在 40％-60％，結尾的 1-3 個堿基好是 G 或 C。
    4. 盡量使引物不要產生非常穩定的二級結構和引物二聚體。
    5. 好使用經過 PAGE 純化的引物或更高純度的引物。

二、待突變模板質粒的選擇
    1. 必需使用從 dam＋的大腸桿菌(這類菌中質粒可以被甲基化)中抽提得到的質粒用于基因定點突變，否則 Dpn I 不能把沒有酶切的質粒 DNA 切除，產生大量的假陽性。必需使用從 dam＋的大腸桿菌(這類菌中質?？梢员患谆?中抽提得到的質粒用于基因定點突變，否則 Dpn I 不能把沒有酶切的質粒 DNA 切除，產生大量的假陽性。
    常用的大部分大腸桿菌都是 dam＋的，包括 DH5α、JM109 等。不能使用 JM110和 SCS110 以及其它 dcm-菌種。
    2. 待突變質粒和目的基因的 GC 含量應該在 40-55％，沒有任何 GC 含量超過 70%、長度在 50bp 以上的區域。如果質粒 GC 含量過高，請先把目的基因克隆到其它合適的載體上，再進行基因定點突變反應。如果目的基因 GC 含量過高，而突變位點不在高 GC 含量區域，可以先把該基因的不含高 GC 含量的一個區域克隆出來，進行定點突變，然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如果突變位點在高 GC 區，則可以使用高 GC PCR 反應試劑。

三、 基因定點突變反應
1. 在一個塑料離心管中加入下列成分：

待突變模板質粒          0.1-0.5 ug
5×高保真酶 Buffer      5 uL
引物一 (10-20 uM)       1 uL
引物二 (10-20 uM)       1 uL
dNTP Mix (2.5 mM each)  4 uL
補水到                  49 uL

2. 加入 1 uL 高保真 DNA 聚合酶，混勻，如果 PCR 儀沒有熱蓋則需要加少量石蠟油。
放入 PCR 儀器中按下面參數進行 PCR：

四、Dpn I 消化：
    PCR 反應后，直接在 PCR 反應體系中加入 1uL Dpn I 內切酶 （該酶在甘油保存液中會下沉到管底，故用前需要充分混勻） 。DpnI 可以酶切雙鏈都被甲基化的模板質粒，也能降解一條鏈被甲基化的雙鏈質粒。混勻后 37℃孵育 2 小時后樣品可以直接用于轉化，或者-20℃保存備用。

五. 轉化、挑克隆鑒定：
    每 100 微升感受態細菌 （轉化效率必須在 10 7 /ug以上） 中可以加入 5-10 微升經過DpnI消化后的突變產物，按照所使用的感受態細菌的操作方法進行操作。如果PCR使用了石蠟油，在轉化時千萬別把它帶入轉化反應，否則會嚴重影響轉化效率。在涂板前通過離心濃縮的辦法，把所有被轉化后的細菌全部涂布到含有適當抗生素的平板上培養。通常會得到 50 個以下的克隆，可按常規方法制備質粒并測序。

六、常見問題：
     1. 轉化后沒有克隆或克隆數極少：(1) 感受態細菌效率不夠高，請檢測一下感受態細胞的效率，確保轉化效率在 10 7 /ug。(2) 把Dpn I消化后的產物用常規的乙醇沉淀濃縮，這樣就可以把所有的產物全部用于轉化。(3) 優化基因定點突變中的PCR參數?？梢园殉醯?95℃變性時間延長為 2 分鐘，循環中 95℃變性的時間延長 1 分鐘，把循環中的 68℃的延伸時間改為 1.5 分鐘/kb 2 分鐘/kb，退火可以改為 60-55℃或 65-55℃等的touch down，退火時間也可以適當延長。(4) 引物設計有問題。通過突變反應中的PCR沒有很好地擴增出預期的突變質粒。
     2. 有克隆， 但沒有或很難檢測到預期的突變克隆： (1) 使用的待突變的模板質粒量過多，導致 Dpn I 消化時不*，可減少質粒用量。
     3. 有突變克隆，但突變位點不是預期的位點：(1) 引物設計不佳，退火溫度過低，導致引物退火到錯誤的地方。(2) 引物質量較差，沒有經過 PAGE 純化。這樣引物中通常會含有比設計的引物要短的特異性較差的引物，容易導致非預期的突變。

三磷酸循環系列試劑盒 一管式點突變試劑盒訂購說明：

1、絕大部分產品備有現貨，一般情況下都能訂貨當日發貨。 
2、部分非常用產品，需提前1－2日預訂，海外期貨則需要提前3-6周預訂。 
3、部分產品價格會因貨期、批次等因素發生變化，若有變動以訂貨當日新價格為準。 
4、每日訂單截止時間為16點整，部分城市可到17點整，因超過截止時間造成當日不能發貨的將于次日安排發貨。
5、請辦理完貨款后，將收據、底單等連同收貨人的地址、姓名、等以傳真、、短信、等形式通知我們。

運輸說明：

1、極低溫產品：極低溫產品運輸過程中加裝干冰運輸。用干冰把產品包裹起來，再用泡沫盒密封，膠帶層層粘住泡沫盒，放入索萊寶的箱子，然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產品的性質穩定如一，為您的實驗保駕護航。
2、低溫產品：低溫產品運輸過程中加裝索萊寶冰袋運輸。事先用冰袋把產品包裹起來，再使用泡沫盒密封，用膠帶嚴實密封泡沫盒，再放入索萊寶的箱子（保溫效果少可以持續一周），然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產品的性質穩定如一，為您的實驗保駕護航。
3、常溫產品：常溫產品運輸過程中無需加冰或者特殊包裝。產品由公司庫房人員快速配貨，準確快速高效的快遞保證產品快速送達您的手中。