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磷酸果糖激酶（PFK）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC0530
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二A：臨用前加入1mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

2. 試劑二B：臨用前加入1mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

3. 試劑二C：臨用前取一支加入0.25mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；

4. 試劑二D：臨用前加入1mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

5. 試劑三：臨用前根據用量按照試劑三:蒸餾水為2μL:13μL（約3T）的體積比例充分混勻，現用現配；

6. 試劑四：臨用前根據用量按照試劑四:蒸餾水為4μL:65μL（約13T）的體積比例充分混勻，現用現配；

7. 工作液的配制：根據樣本量按試劑一：試劑二A：試劑二B：試劑二C：試劑二D =22mL：0.5mL：0.5mL：0.25mL：0.5mL（約29T）的比例配制工作液，現用現配；

產品說明：
磷酸果糖激酶（Phosphofructokinase，PFK，EC 2.7.1.11）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，負責將果糖-6-磷酸和ATP轉化為果糖-1,6二磷酸和ADP，是糖酵解過程的關鍵調節酶之一。
PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，*酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PFK活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。


需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、水浴鍋/恒溫培養箱、臺式離心機、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
“具體操作步驟詳見“產品資料"附件"
注意事項：

1. 
   

1. 
   

2. 測定過程中試劑三、試劑四和樣本在冰上放置，以免變性和失活。

3. 比色皿中反應液的溫度必須保持37℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。

4. 最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。

5. 若ΔA大于0.5，需將酶液用酶提取液稀釋，使ΔA小于0.5，可提高檢測靈敏度。注意同步修改計算公式。

6. 
   

實驗實例：

1. 取0.1g黑麥草加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA= A1-A2 = 1.375-0.995=0.380，按樣本質量計算酶活得：

PFK活性（U/g 質量）=450×ΔA ÷W=450×0.380 ÷0.1=1710 U/g 質量。

1. 取0.1g桃葉加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA= A1-A2 = 1.38-1.323=0.057，按樣本質量計算酶活得：

PFK活性（U/g 質量）=450×ΔA ÷W=450×0.057 ÷0.1=256.5 U/g 質量。
參考文獻：

1. Papagianni M, Avramidis N. Lactococcus lactis as a cell factory: a twofold increase in phosphofructokinase activity results in a proportional increase in specific rates of glucose uptake and lactate formation[J]. Enzyme and microbial technology, 2011, 49(2): 197-202.

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