氯霉素酶聯免疫（ELISA）快速檢測試劑盒
1 概要
氯霉素 （Chloramphenicol, CAP） 是一種廣譜抗生素。具有良好的抗菌效果且價格低廉，廣泛應用于家畜禽的各種傳染性疾病的治療。但是氯霉素有嚴重的副作用，它已被證實會抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細胞缺乏癥等。近年來，食品中的氯霉素殘留對人類的健康造成了*的威脅。因此，發展快速、簡便而且又準確的氯霉素檢驗試劑成為了近年來食品分析界十分關注的課題。傳統上常用HPLC 與TLC 來作為抗生素檢測的方法，但效率低、靈敏度也達不到要求。本公司研發的氯霉素酶聯免疫檢驗試劑盒，操作簡便、耗時短、檢測樣品多，特異性高，且檢測敏感度zui低可達0.025ppb。
本試劑可用于檢測生乳、蜂蜜、蜂王漿、魚、蝦、蟹、烏賊、雞肉、豬肉、飼料及血清等的氯霉素殘留。
2 原理
本試劑盒采用直接競爭ELISA 法檢測樣本中氯霉素。在微孔板上預包被抗氯霉素抗體，樣本或標準品溶液中的氯霉素和HRP 標記的氯霉素競爭結合微孔板中抗氯霉素抗體，洗滌后用底物顯色，樣本吸光值與其所含氯霉素成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中氯霉素的含量。
3 試劑盒組份
每個試劑盒中的試劑可進行48 個測定（包括標準測定），試劑盒組份：
CAPAb 酶標板------------------------------48 孔（包被有抗氯霉素抗體）
氯霉素標準品溶液-----------------------------6 瓶（1.5 mL/瓶）
0 號：0 ppb ；1 號：0.025 ppb ；2 號：0.05 ppb ；3 號：0.1 ppb ；4 號：0.3 ppb ；
5 號：0.6 ppb
氯霉素酶標記物----------------------------------1 瓶（8mL）
10×濃縮洗滌液----------------------------------1 瓶（30mL）
10×濃縮提取劑----------------------------------1 瓶（30mL）
底物溶液----------------------------------------1 瓶（12mL）
終止液------------------------------------------1 瓶（12mL）
封板膜------------------------------------------3 張
說明書------------------------------------------1 份
質檢報告----------------------------------------1 份
4 另外所需儀器和試劑
4.1 儀器
— 微孔板酶標儀（450nm）
— 振蕩器
— 均質機
— 離心機，離心管和玻璃試管
— 可調式5μL-50μL、 20μL-200μL 和100μL-1000μL 微量移液器
— 氮吹儀
4.2 試劑
— 乙酸乙酯（Ethyl acetate）
— 正己烷（n-Hexane）
— 0.5 N 鹽酸溶液（HCl）
— 0.5 N 氫氧化鈉溶液（NaOH）
5 樣本處理
5.1 待測物為生乳，請先參考注意事項第9，10點
− 現配1×提取劑：10×濃縮提取劑用蒸餾水稀釋10 倍后使用。（如1 mL 濃縮稀釋液加9 mL
蒸餾水稀釋）
− 取250μL 乳品于1.5mL 離心管
− 加入750μL 現配1×提取劑，快速震蕩30秒鐘后備用
稀釋倍數: 4
5.2待測物為蜂蜜
− 取2 g蜂蜜、4mL蒸餾水與4mL乙酸乙酯于15mL離心管中，震蕩30秒
− 持續上下顛倒該離心管10分鐘，使其充分混合均勻
− 以5000rpm離心10分鐘，取1 mL上層液（乙酸乙酯）至10mL玻璃試管中，于50℃下，利用氮
氣將有機溶相吹干
− 加入0.5 mL 1×提取劑，震蕩30秒鐘后備用
稀釋倍數: 1
5.3 待測物為蜂王漿
− 取2g蜂王漿、3mL 0.5M NaOH及8 mL乙酸乙酯置入15mL離心管中，震蕩30秒
− 持續上下顛倒該離心管10 分鐘，使其充分混合均勻
− 以5000rpm離心10分鐘，取2mL上層液（乙酸乙酯）至10 mL玻璃試管中，于50 ℃下，利用氮
氣將有機溶相吹干
− 加入0.5 mL1×提取劑，震蕩30秒鐘后備用
稀釋倍數: 1
5.4 待測物為魚、蝦、蟹、烏賊、雞肉、豬肉及血清
− 將3克已均質的樣品放入15mL離心管中，再加入6mL乙酸乙酯，震蕩5分鐘
− 以5000rpm離心10分鐘，取2mL上層液（乙酸乙酯）至10mL玻璃試管中，于50℃下，利用氮氣將有機溶相吹干
− 于此玻璃試管中加入正己烷1mL，先將殘余物*溶解后，再加入1mL 1×提取劑，震蕩30
秒鐘
− 以5000rpm離心10分鐘，吸去包含中間乳化層的上層液（正己烷），再吸取下層液（水層）備
用
稀釋倍數: 1
5.5 待測物為白蝦
− 將6克已均質的樣品放入15mL離心管中，再加入6 mL乙酸乙酯，震蕩5分鐘
− 以5000rpm離心10分鐘，取4mL上層液（乙酸乙酯）至10 mL玻璃試管中，于50℃下，利用氮
氣將有機溶相吹干
− 于此玻璃試管中加入正己烷2mL，先將殘余物*溶解后，再加入0.5mL 1×提取劑，震蕩30秒鐘
− 以5000rpm離心10分鐘，吸去包含中間乳化層的上層液（正己烷），再吸取下層液（水層）備
用稀釋倍數: 0.125
5.6 待測物為飼料
− 取2 g飼料與4 mL乙酸乙酯置入15mL離心管中，震蕩30秒
− 持續上下顛倒該離心管10分鐘，使其充分混合均勻
− 以5000rpm離心10分鐘，取1mL上層液（乙酸乙酯）至10mL玻璃試管中，于50℃下，利用氮氣將有機溶相吹干
− 于此玻璃試管中加入正己烷1mL，先將殘余物*溶解后，再加入0.5mL 1×提取劑，震蕩30秒鐘
− 以5000rpm離心10分鐘，吸去包含中間乳化層的上層液（正己烷），再吸取下層液（水層）稀
釋10倍后（如50μL下層液加450μL 1×提取劑）備用
稀釋倍數: 10
5.7 待測物為全蛋
− 取1 g全蛋液，加入0.5N HCl 0.5 mL后快速震蕩30秒
− 加入4mL乙酸乙酯后快速震蕩30秒使其混合均勻
− 以5000rpm離心10分鐘，取2mL上層液（乙酸乙酯）至10mL玻璃試管中，于50 ℃下，利用氮
氣將有機溶相吹干
− 于此玻璃試管中加入正己烷1mL，先將殘余物*溶解后，再加入0.5mL 1×提取劑，震蕩30秒
− 以5000rpm離心10分鐘，吸去包含中間乳化層的上層液（正己烷），再吸取下層液（水層）備
用。
稀釋倍數: 1
注1：若乳化現象太嚴重，看不到下層液有澄清部分，請先將玻璃試管中大部分上層液取出，
剩余乳化部份用80～100℃水浴3分鐘后再離心。
注2：因為利用乙酸乙酯萃取的流程可能有溶劑的背景值過高的現象，建議做一個溶劑背景
值的樣品。待測物的濃度等于所得濃度減去溶劑背景值的濃度再乘以稀釋倍數。
注3：得到溶劑背景值的濃度的方法：不加待測物，從把適量的乙酸乙酯移入玻璃試管中做
起到完成整個提取流程，后用于檢測。
6 注意事項
Ø 試劑盒保存于2-8°C，不能冷凍，未用的微孔板放回原鋁箔袋密封后2-8°C 存放，并
盡快使用，底物溶液要避光保存。
Ø 使用之前，將樣本及所需試劑的溫度平衡至20-25°C，否則可能導致后面檢測吸光度
值偏低。試劑使用完后應立即放回2-8°C 冰箱。
Ø 10×提取劑與10×洗滌液用蒸餾水稀釋10 倍后使用。（如1 mL 濃縮液加9 mL 蒸餾水），
1×提取劑和1×洗滌液可于4 ℃保存一周。
Ø 提取流程請使用 P.P.材質的15 mL 離心管以免腐蝕。
Ø 反應終止液含0.5 N HCl，請小心操作。
Ø 氯霉素標準溶液含氯霉素，請小心操作。
Ø 不要使用過期的試劑盒，不同批號試劑不能混用。
Ø ELISA 所得的氯霉素濃度若低于該樣品檢品敏感度即可視為該樣品背景值，無須回乘稀
釋倍數。若所得的氯霉素濃度高于該樣品檢品敏感度，即可能為氯霉素陽性樣品，建議
使用其它檢測方法檢測，如GC/MS 等。
Ø 進行生乳的樣本制備時，在 ELISA 操作時中充分混勻（操作步驟的第四點）。
Ø 陰性生乳的OD450 吸光值可能會高于標準品0 ppb 的吸光值但不會影響對氯霉素陽性
樣本的判定。
7 檢測步驟
7.1 取好所需板條固定于板架后編號，建議每個標準品溶液和待測樣本均做復孔。
7.2 加樣：每孔加入標準品溶液或樣本提取液100μL，然后每孔分別加入氯霉素酶標記物
50μL。
7.3 溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于室溫避光反應1小時。
7.4 洗滌：小心揭開封板膜，將孔內液體甩干，加入1×洗滌工作液250 μL/孔，充分洗滌3
次，每次間隔小于5 秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。
7.5 顯色：每孔加入底物溶液100μL，輕輕振蕩混勻，室溫下避光靜置20 分鐘。
7.6 測定：每孔加入終止液100μL，輕輕振蕩混勻，5 min 內測定450 nm 處吸光度值。
8 結果判定
8. 1 計算B/B0
所獲得的標準品溶液或待測樣本的吸光值（B）除以0 號標準品溶液的吸光值（B0）再乘以*，即為百分吸光值。
百分吸光值（%）= B/B0× *
式中：B — 標準品溶液或待測樣本的吸光值
B0 — 0 號標準品溶液的吸光值
8.2 繪制標準曲線，計算樣本中氯霉素濃度
以氯霉素標準品溶液濃度為X 軸，對應的百分吸光值為Y 軸，在半對數坐標紙上繪制標準曲線。相對應每一個樣本的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本中氯霉素的濃度。
9 檢測限、準確度、精密度、特異性
試劑盒靈敏度：0.025 ppb
各樣本zui低檢測限：
生乳、蜂蜜、蜂王漿：0.1 ppb
血清、蛋、魚蝦蟹雞豬肉：0.025 ppb
飼料：0.25ppb
回收率（準確性）：
生乳（添加0.25 ppb） 70～110%
蜂蜜（添加0.1 ppb） 90～130%
蜂蜜（添加0.3 ppb） 90～130%
蜂王漿（添加0.3 ppb） 80～120%
魚、蝦、蟹、烏賊、雞及豬肉（添加0.1 ppb） 75～125%
魚、蝦、蟹、烏賊、雞及豬肉（添加0.3 ppb） 75～125%
飼料（添加2.0 ppb） 90～130%
血清（添加0.3 ppb） 80～120%
蛋（添加0.3 ppb） 80～120%
精密度：
試劑盒變異系數小于10%
交叉反應率（特異性）：
Chloramphenicol ····························· *
Chloramphenicol（free base） ························ 1.4%
Gentamicin ······························· <0.1%
Thiamphenicol ······························ 3.1%
Tetracycline ······························ <0. 1%
Penicillin ······························· <0.1%
Sulfamethazine ····························· <0.1%
10 儲存條件
2-8°C 貯存。
11 有效期
未開封試劑盒有效期為12 個月，開封后3 個月內用完。（見包裝盒上標簽有效期）____
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