小鼠腫瘤浸潤組織白細胞分離液試劑盒（細胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)）說

明書

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：

 名稱 產(chǎn)品編號 規(guī)格

A 各種動物組織白細胞分離液 詳見附錄 1 100ml

B F 液（贈品） F2013TBD 100ml

C 紅細胞裂解液（贈品） NH4CL2009 100ml

D 全血及組織稀釋液（贈品） 2010C1119 100ml

E 細胞洗滌液（贈品） 2010X1118 100ml

注：本試劑內(nèi)容中各單品可根據(jù)貨號單獨購買，客戶可根據(jù)實際使用情況自行選擇購買。

【預(yù)期用途】

適用于從動物組織中分離白細胞，無菌條件下所分離的白細胞可用于分子生

物學(xué)及細胞培養(yǎng)等。本品僅供科研使用。

【檢驗原理】

本分離液為 FICOLL、羥乙一基淀粉 550 與泛影酸葡甲胺的混合液。抗凝血液

可在分離液中分層。離心時，在 FICOLL、羥乙一基淀粉的作用下紅細胞與粒細胞

聚集并迅速沉降；此時，白細胞仍處于分離液上層及分離液層，紅細胞污染可通

過紅細胞裂解液裂解紅細胞去除。大部分血小板可在細胞清洗低速離心過程中去

除。

其他人及動物多種比重細胞分離液，因不同種屬不同比重分離液的細胞離散

系數(shù)及細胞帶電不同，用戶在制定分離液時應(yīng)提供所需分離液的比重、動物種屬

及被分離細胞的名稱。

【*但不提供的儀器及耗材】

可提供 400g 離心力的水平轉(zhuǎn)子離心機、15ml 玻璃離心管、吸管及標準胎牛血清

（產(chǎn)品編號：TBD31HB）等。

【注意事項】

1. 使用前，本分離液需復(fù)溫至 18-22℃。為獲得*的實驗結(jié)果，在獲得

樣本 2 小時內(nèi)進行實驗，存放時間越長細胞活性越低。

2. 實驗過程中，如需勻漿組織或洗滌細胞，不可使用含 Ca、Mg 離子的緩沖液及

培養(yǎng)液，其成分會大大降低細胞得率及純度。本公司生產(chǎn)的全血及組織稀釋液和

細胞洗滌液不含 Ca、Mg 離子、低內(nèi)毒素水平且含細胞和保護成分，推薦使用。

3. *抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素，其他抗凝劑也可使用，但會影響細

胞活性。

4. 實驗操作時，不可使用含粉手套、不可使用內(nèi)毒素含量過高的液體，手套中

的粉末顆粒及高內(nèi)毒素會激活細胞從而降低細胞得率及活性。建議使用天津灝洋

配套相關(guān)產(chǎn)品。

5. 本實驗不可使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，其帶有的靜電作用

將導(dǎo)致細胞貼壁影響分離效果。

6. 吸取過多的白細胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使

混雜的粒細胞數(shù)量增加。

7. 吸取過多的白細胞層上層溶液會導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

8. 如需進行細胞計數(shù)，則需樣本貯藏時間不得多于 10 小時，否則將導(dǎo)致細胞被

激活，得率降低。

9. 為去除所混雜的血小板，可在分離液上層加上 4-20%蔗糖梯度等滲溶液進行

二次離心。

10. 細胞純度可在步驟 10 后使用瑞氏染色方法確定，細胞活性可用臺盼藍處理

后觀察。

11. 如所實驗后細胞得率或活性過低，請?zhí)旖驗笠詫で髱椭?/span>

體詳見“【生產(chǎn)企業(yè)】”項目下內(nèi)容。

【組織單細胞懸液的制備方法】

注： A. 組織勻漿液需先用現(xiàn)配，配制方法為：40ml 胎牛血清與 60mlF 液混勻，備用（現(xiàn)

用現(xiàn)配）。

B．本試劑盒中不包含膠原酶，若采用酶消化法制備單細胞懸液，請用戶根據(jù)各實驗

室要求另購不同類型膠原酶。

Ⅰ. 剪碎法：將組織塊放入平皿后，加入少量組織勻漿液；用眼科剪將組織剪至

勻漿狀，加入 5ml 組織勻漿液；用吸管吸取組織勻漿，用 100 目不銹鋼濾網(wǎng)(另

購)過濾到試管內(nèi)；離心沉淀 1500 轉(zhuǎn)/分×3 min，再用細胞洗滌液清洗 3 次，每

次以 500rpm 短時低速離心除去細胞碎片，以 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾去

細胞團塊。作細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為（2～5）×107個/ml。常溫下放置, 待

測細胞的活力。分離前用全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108

-1×109個/ml

的單細胞懸液備用。

Ⅱ. 勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入 70ml 組織研磨器內(nèi)，加入 2ml

組織勻漿液；緩慢轉(zhuǎn)動研棒，研磨至勻漿；用 5ml 組織勻漿液沖洗研器；收集細

胞懸液，經(jīng) 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾；離心沉淀 800rpm×2min ，再用細

胞洗滌液洗 3 次，離心沉淀。作細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為（2～5）×107個/ml。MANUFACTURE CO.,LTD - 3 -

www.tbdscience.com◆:gx

灝洋生物 TBDsciences

常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108

-1×109個/ml 的單細胞懸液備用。

Ⅲ. 酶消化法：

A． 用 F 液將膠原酶稀釋，終濃度為 400 U/ml，至于冰浴備用。

B． 取一適當(dāng)大小培養(yǎng)皿進行操作：用鑷子夾碎動物脾臟，加入稀釋后的膠原酶，

37℃消化 20 分鐘。

C． 以 100 或 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾，離心沉淀 800prm×2min ，再用

細胞洗滌液洗 3 次，離心沉淀。作細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為（2～5）×107

個/ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用全血及組織稀釋液懸起細

胞濃度為 2×108

-1×109個/ml 的單細胞懸液備用。

細胞計數(shù)方法:

細胞計數(shù)法是用來計數(shù)細胞懸液中細胞數(shù)量的一種方法。一般利用計數(shù)板

（血球計數(shù)板）進行。既可用于分離（散）細胞培養(yǎng)接種前計數(shù)所制備的細胞懸

液中的細胞數(shù)量，也可用于對培養(yǎng)物的細胞數(shù)量進行計數(shù)。不論計數(shù)的對象如何，

均須制備分散的細胞懸液。

計數(shù)與計算過程

1）、在細胞計數(shù)板中央放置計數(shù)的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計數(shù)板凹蹧處流

出懸液，至蓋玻片被液體充滿為止。

3）、置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細胞總數(shù)。對于壓線的細胞只計數(shù)在上

線和左線者，對于細胞團按單個細胞計數(shù)。

4）、按下式計數(shù)細胞懸液的密度：

細胞密度＝（4 個大格細胞總數(shù)/4）×104個/ml×稀釋倍數(shù)

公式中乘以 104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3

細胞計數(shù)要點：

A． 進行細胞計數(shù)時，要求懸液中細胞數(shù)目不低于 104個/ml，如果細胞數(shù)目很

少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計數(shù)時，遇到 2 個以上細胞組成

的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算。如果細胞團>10％，說明細胞分散不充分; 或細

胞數(shù)<200 個/10mm2或>500 個/10 mm

2 時，說明稀釋不當(dāng)，需重新制備細胞懸液。

B． 要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數(shù)準確性。

C． 取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細胞懸液，尤其是多次取樣計數(shù)時更要注意每次

取樣都要混勻，以求計數(shù)準確；

D． 數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計

算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。

E． 操作時，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要

重新計數(shù)。

初學(xué)者易犯的錯誤：

A． 計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。

B． 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

C． 滴入懸液時的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

【檢驗方法】

1. 取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液置于 18-22℃。

2. 取 3ml 細胞懸液小心加于分離液之液面上。18-22℃，400g 離心 20 分鐘。低

溫（如 4 度）離心會降低細胞得率。

3. 離心后，用吸管小心吸出分離液上層（包含白細胞的細胞層）0.5cm 以上的

上清液部分，棄去。

4.用吸管小心吸取分離液層、白細胞層及紅細胞層置于另一新離心管內(nèi)。

5. 在步驟 4 中所得離心管中加入 10ml 細胞洗滌液（產(chǎn)品編號：2010X1118）混

勻。

6. 250g 離心 10 分鐘。

7. 棄上清，沉淀使用紅細胞裂解液（Cat#：NH4CL2009）裂解紅細胞（裂解過程

參見下述【紅細胞裂解液使用說明】）。

8. 裂解后再經(jīng)三次洗滌去除紅細胞內(nèi)溶物和碎片后即為所需白細胞。

9.后以 0.5ml 后續(xù)試驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。

WBC Separation Medium

【紅細胞裂解液使用說明】

本裂解液有別于市場上銷售的其它紅細胞裂解液，其配方經(jīng)過本公司優(yōu)化在裂解紅細

White Blood

Cell

20 Minutes

Cell Suspension Diluentwww.tbdscience.com

本品只能用于科學(xué)研究，不能用于臨床檢測

胞的同時不損傷并在一定程度上保護淋巴細胞(lymphocyte)或其它有細胞核的細胞，所獲

得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態(tài)。另外，本裂解液中無DNA及RNA酶，配

合細胞分離液使用所提細胞可廣泛用于細胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)實驗，請廣大用戶從優(yōu)選擇。

紅細胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也稱ACK Lysis Buffer，是一種用于

從人或鼠等的血液或組織細胞樣品中裂解并去除無細胞核紅細胞的溶液。

本裂解液不適用于有細胞核紅細胞的裂解，例如鳥或禽類的紅細胞。本裂解液經(jīng)過無菌

處理，處理過的血液或組織細胞樣品可以用于后續(xù)的原代培養(yǎng)、細胞融合以及核酸或蛋白的

提取及各種常規(guī)的分析和檢測。

使用說明：

A. 對于組織細胞樣品：

a. 新鮮組織經(jīng)過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當(dāng)方法分散成細胞懸液，離心棄上清。

b. 加入3-5倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細胞沉淀的體

積為1ml，則加入3-5ml的紅細胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不

會影響后續(xù)的一些檢測。

e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g離心

2-3分鐘，棄上清。可再重復(fù)1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應(yīng)至少為細胞沉淀

體積的5倍。4℃離心效果更佳。

f. 根據(jù)實驗需要用適當(dāng)溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗。

B. 對于組織細胞樣品無需洗滌的快速操作步驟：

a. 新鮮組織經(jīng)過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當(dāng)方法分散成細胞懸液，離心棄上清。

b. 對于0.2ml細胞沉淀加入1ml紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。本步驟在室溫

或4度操作均可。

c. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，混勻。

d. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

e. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不

會影響后續(xù)的一些檢測。

f. 根據(jù)實驗需要用適當(dāng)溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗。

注：對于常規(guī)步驟，多一步洗滌過程中的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更好一些，

時不需要大體積的離心管。快速步驟少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時需要大體積的離心管。

C. 對于血液樣品：

a. 取新鮮抗凝血，400-500g離心5分鐘，離心棄上清。

b. 加入6-10倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細胞沉淀的體

積為1ml，則加入6-10ml的紅細胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。注意：對于鼠

的血液，裂解1-2分鐘已經(jīng)足夠，對于人的外周血，宜延長裂解時間至4-5分鐘，并且裂

解過程中宜適當(dāng)偶爾搖動以促進紅細胞裂解。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不

會影響后續(xù)的一些檢測。

e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g離心

2-3分鐘，棄上清。可再重復(fù)1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應(yīng)至少為細胞沉淀

體積的5倍。4℃離心效果更佳。

f. 根據(jù)實驗需要用適當(dāng)溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗。

注：對于微量或少量的血液樣品，可以在*步中不進行離心棄上清的操作，直接在第二步中加入10倍血

液體積的紅細胞裂解液，并在室溫或4℃裂解4-5分鐘。對于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經(jīng)足夠，對于人的外

周血，宜延長裂解時間至10分鐘，但通常不宜超過15分鐘，并且裂解過程中宜適當(dāng)偶爾搖動以促進紅細胞

裂解。后續(xù)步驟相同。

D. 對于血液樣品無需洗滌的快速操作步驟：

a. 每1ml新鮮抗凝血中加入10ml紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解4-5分鐘。本步驟在室

溫或4度操作均可。注意：對于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經(jīng)足夠，對于人的外周血，宜

延長裂解時間至10分鐘，但通常不宜超過15分鐘，并且裂解過程中宜適當(dāng)偶爾搖動以促

進紅細胞裂解。

b. 加入20-30ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，混勻。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不

會影響后續(xù)的一些檢測。

e. 根據(jù)實驗需要用適當(dāng)溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗。

注：對于常規(guī)步驟，多一步洗滌過程的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更好一些，同時

不需要大體積的離心管。快速步驟少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時需要大體積的離心管。

【儲存條件及有效期】 www.tbdscience.com

18-25℃避光保存，有效期 2 年。啟封后置 4℃保存，溶液變渾濁或感染細

菌時，產(chǎn)品失效。本品為真空包裝，未啟封前置于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，

影響分離效果。

【適用儀器】

半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子離心機。

【樣本要求】

本分離液要求樣本為新鮮的細胞懸液，樣本收集時應(yīng)無菌操作且在儲存、處

理和運輸過程中避免冷凍和冷藏。

【參考值（參考范圍）】

本實驗白細胞的提取率及純度均大于 80%。

【檢驗結(jié)果的解釋】

由于各品牌離心機的性能不同，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能

影響分離效果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心的時間，摸索*的分離條件（具

體分離條件各實驗室自定）。

【檢驗方法的局限性】

本試驗要求，在正常大氣壓下，樣本、分離液及分離環(huán)境溫度為 18-22℃。

本分離液在低溫時呈較高密度，在高溫時呈較低密度。

【產(chǎn)品性能指標】

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

無菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清

澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μ m 以上的不溶性微粒 20 粒以

下，含 25μ m 以上的不溶性微粒 5 粒以下

【參考文獻】

1 鄭德先，吳克復(fù)，褚建新.現(xiàn)代實驗血液學(xué)研究方法與技術(shù).北京醫(yī)科大學(xué)

協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1999

2 鄂征.組織培養(yǎng).北京出版社，1995

3 朱立平，陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實驗方法.人民軍醫(yī)出版社，2000