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檢測原理：

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。

3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。

4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。

5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1. 酶標(biāo)儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

操作注意事項

1. 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20 分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。

2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3. 濃度為0 的S0 號標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對照或者空白；預(yù)處理后的樣本無需稀釋，直接取50μL 加樣即可。

4. 嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5. 所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

名稱96孔配置48孔配置備注

微孔酶標(biāo)板12 孔×8 條12 孔×4 條無

標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL*6 管0.3mL*6 管無

生物素1mL 0.5mL 無

檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無

20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明書進(jìn)行稀釋

底物A 6mL 3mL 無

底物B 6mL 3mL 無

終止液6mL 3mL 無

封板膜2 張2 張無

說明書1 份1 份無

自封袋1 個1 個無

注：標(biāo)準(zhǔn)品（S0-S5）濃度依次為：0、15、30、60、120、240 pg/mL

試劑的準(zhǔn)備

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20 稀釋，即1 份的20×洗滌緩

沖液加19 份的蒸餾水。

洗板方法

1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min 后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5 次。

2. 自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5 次。

操作步驟

1. 從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3. 待測樣本孔先加生物素10μL，再加待測樣本50μL；

4. 隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5 次（也可用洗板機洗板）。

6. 每孔加入底物A、B 各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入終止液50μL，15min 內(nèi)，在450nm 波長處測定各孔的OD 值。

結(jié)果判斷

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel 工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD 值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

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