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培養(yǎng)箱中微生物菌種保藏方法及注意點
閱讀：1619 發(fā)布時間：2019-12-131、傳代保存法：有些微生物當遇到冷凍或干燥等處理時，會很快死亡，因此在這種情況下，只能求助于傳代培養(yǎng)保存法。傳代培養(yǎng)就是要定期地進行菌種轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)后再保存，它是基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產(chǎn)菌種的保存。
傳代保存時，培養(yǎng)基的濃度不宜過高，營養(yǎng)成分不宜過于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在可能的范圍內(nèi)盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低于適生長溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種，則應(yīng)在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣。
一般地，大多數(shù)菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。
傳代培養(yǎng)保存法雖然簡便，但其缺點也很明顯，如：①菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉；②菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異；③反復(fù)傳代時，菌株的病原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期轉(zhuǎn)種，工作量大；⑤雜菌的污染機會較多。
2、液體石蠟覆蓋保存法：該法較前一種方法保存菌種的時間更長，適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細菌等的保存。此法可防止干燥，并通過限制氧的供給而達到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法簡便的優(yōu)點，同時也適用于不宜冷凍干燥的微生物（如產(chǎn)孢能力低的絲狀菌）的保存，而某些細菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進行保存。
3、載體保存法：即將微生物吸附在適當載體上進行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種，如①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進行干燥或使菌體繁殖后再干燥，然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜，土壤需風干、粉碎、過篩和滅菌。
使微生物在土壤中繁殖后進行干燥保存的方法是：取適量土壤（5克）置于塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養(yǎng)基（以含水量為土壤大持水量的60%為宜），然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進行大量接種，培養(yǎng)至菌絲能用肉眼確認的程度為止，移入干燥器中經(jīng)短時間干燥或風干后密封，冷藏或室溫保存。
②砂土保存法：取清潔的砂，過60目篩去掉大砂粒，并用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗數(shù)次，干燥后，置于試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經(jīng)干熱滅菌后，加入1ml菌種培養(yǎng)液，經(jīng)充分混勻后，放入真空干燥器中，*干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂（經(jīng)HCl預(yù)處理）和一份貧瘠、過篩的黃土攙和后滅菌，再進行菌種保藏。
③硅膠保存法：以6～16目的無色硅膠代替砂子，干熱滅菌后，加入菌液。加菌液時，由于硅膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設(shè)法加以冷卻。
④磁珠保存法：將菌液浸入素燒磁珠（或多孔玻璃珠）后再進行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠（或無水CaSO4），上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經(jīng)干熱滅菌后，接入菌懸液，后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對酵母菌很有效，特別適用于根瘤菌，可保存長達兩年半時間。
⑤麩皮保存法：在麩皮內(nèi)加入60%的水，經(jīng)滅菌后接種培養(yǎng)，后干燥保藏。
⑥紙片（濾紙）保存法：將滅菌紙片浸入培養(yǎng)液或菌懸液中，常壓或減壓干燥后，置于裝有干燥劑的容器內(nèi)進行保存。
4、懸液保存法：即使微生物混懸于適當溶液中進行保存的方法。常用的有，①蒸餾水保存法：適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌，將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數(shù)年。本法應(yīng)注意避免水分的蒸發(fā)。
②糖液保存法：適用于酵母菌，如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗處保存，可長達10年。除此之外，也可使用緩沖液或食鹽水等進行保存。
5、寄主保存法：即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。
6、冷凍保存法：適用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷，而對其它大多數(shù)微生物而言，無論在細胞外凍結(jié)還是在細胞內(nèi)凍結(jié)，都會對菌體造成損傷，因此當采用這種保藏方法時，應(yīng)注意以下幾點，①要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞；②要選擇適宜的培養(yǎng)基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異；③要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長；④在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)（如食鹽等）；⑤可在菌液內(nèi)添加甘油等保護劑，以防止在冷凍過程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時更有效。
⑥原則上應(yīng)盡快進行冷凍處理，但當加入保護劑時，可靜置一段時間后再進行處理。
⑦就動物細胞而言，應(yīng)在－20℃范圍內(nèi)以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多數(shù)微生物而言，則不必如此，如結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原蟲則可在－35℃范圍內(nèi)進行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍；⑧若進行長期保存，則貯藏溫度越低越好；⑨取用冷凍保存的菌種時，應(yīng)采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應(yīng)選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后，應(yīng)盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。
常用的冷凍保存法包括：
①低溫冰箱保存法（－20℃、－50℃或－85℃）：低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多，有些可添加保護劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi)，再放入低溫冰箱內(nèi)進行保存的。
②干冰保存法（－70℃左右）：即將菌種管插入干冰內(nèi)，再置于冰箱內(nèi)進行冷凍保存。
③液氮保存法（－196℃）：是適用范圍廣的微生物保存法。其操作步驟如下，a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當防凍劑（保存霉菌不用防凍劑）的滅菌溶液中，將0.2～1ml的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或?qū)⒕z體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。
b、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中（－150℃～－170℃）時，則不需熔封。
c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當?shù)纳厝芤褐薪?～30分鐘后，觀察有無色素進入安瓶。
d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至－25℃左右，也可在－20℃～－25℃的冰箱內(nèi)緩慢冷卻30～60min。
e、速冷：后浸入液氮中快速冷卻至－196℃。
7、冷凍干燥保存法：其原理是首先將微生物冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分。事實上，從菌體中除去大部分水分后，細胞的生理活動就會停止，因此可以達到長期維持生命狀態(tài)的目的。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種（包括噬菌體和立克次氏體等）的保存。
在進行冷凍干燥時，需注意以下幾個問題：
a、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗菌種純度。一般地說，將待保存的微生物在營養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)為宜；菌齡以達到對數(shù)生長期為好；若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進行保存為好；菌液濃度以高為好，如細菌應(yīng)達到109～1010/ml。
b、菌株號碼等的標記：可在安瓶外側(cè)標記或在安瓶內(nèi)封入標簽。
c、安瓶的準備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜，自來水沖洗3次后，蒸餾水刷凈，干燥，塞棉塞，貼標簽，干熱滅菌或溫熱滅菌后，60℃恒溫干燥。
d、添加保護劑：常用的保護劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等。
8、Bordelli氏法：取干凈的小試管（8×60mm）塞上棉塞，滅菌。用滅菌的脫脂牛乳洗脫試管斜面上的菌苔，制成濃厚菌懸液。然后用無菌吸管將菌懸液滴入小試管底部。每管一滴，然后轉(zhuǎn)動小試管使菌液分散在試管底部的壁上。標記菌名。將小試管裝在15×150mm的試管中，在大試管底部事先裝上1.5cm高的（P2O5或KOH），管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊，蠟封。將大試管與真空泵連通，抽真空至0.1～0.2mm汞柱時，將玻璃管熔封，置室溫暗處或冰箱保存。
儀器與材料1、斜面菌種：絲狀真菌、酵母菌、芽孢桿菌和無芽孢桿菌各一支。
2、接種用具一套。
3、滅菌物品：1ml、5ml吸管，長滴管，安瓶管，9ml無菌水試管，砂土管，液體石蠟，脫脂牛乳。其中，液體石蠟的處理為1.5kg/cm2壓力滅菌1小時或1kg/cm2壓力滅菌3次，每次30分鐘。接著檢查是否*無菌，即接入肉湯中檢查有無雜菌生長。后放在60～80℃轟烤以去除水分。脫脂牛乳的處理為2000rpm離心10分鐘脫脂，然后0.5kg/cm2壓力滅菌20分鐘，或間歇滅菌3次，經(jīng)檢查無菌后備用。
4、P2O5，無水CaCl2各一瓶。
5、真空干燥器，真空泵。
方法1、液體石蠟覆蓋法：取待保存的菌種斜面，用5ml無菌吸管向內(nèi)加入滅菌石蠟，要求液體石蠟高出菌斜面1cm左右，若不夠此高度，則常會引起斜面抽干現(xiàn)象。
2、砂土管法：用1ml無菌吸管吸取0.2～0.5ml菌懸液，滴入砂土管中，充分混勻后，將砂土管放入真空干燥器內(nèi)，抽干，真空干燥器內(nèi)需放置無水CaCl2。后，將干燥好的砂土管取出，迅速于火焰上蠟封管口，并在室溫下或冰箱中進行保存。
3、冷凍干燥保藏法：
①用滅菌長滴管取出2滴（約0.1ml）無菌脫脂牛乳，置于無菌安瓶管中，然后用另一支無菌滴管取出等體積的濃菌液，同樣置于此安瓶管中，充分混勻。
②集中安瓶管，置于100ml燒杯中，將燒杯裝進真空冷凍干燥器的鐘罩內(nèi)，開機并開冷卻水后，使菌液在－20℃溫度下迅速凍結(jié)成固體，然后抽真空使水分升華，2小時后，可以停止冷凍并在稍高的溫度下進行干燥，直至全干為止。
③后取出安瓶管，并將其與真空泵連接，再抽真空后，迅速將安瓶管熔封，后冰箱保存。
4、甘油管保藏法：在5ml菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后，于－20℃冰箱中保存。