當前位置:上海美軒生物科技有限公司>>技術文章>>流式細胞術中熒光補償該如何調節?
在討論流式細胞術中熒光補償該如何調節的問題前,我們先了解下流式實驗為何需要調補償?
熒光分子在被激發后都會發射特定波長范圍的光,但是這些熒光的發射光之間會發生光譜重疊。
熒光補償的調節是糾正熒光素發射光譜重疊的過程,即從一個被檢測的熒光信號中減掉溢漏過來的其他光。
熒光發射光光譜重疊示例:
以FITC和PE為例來看光譜重疊。FITC單染管的熒光會部分漏到PE通道中,而這部分需要從PE通道中減掉溢漏過來的FITC熒光。
那么熒光補償該如何調節呢?
? 調節電壓
? 檢測熒光通道的自發熒光
? 每個熒光通道做單染管對照檢測
何為單染管對照?
? 細胞
? 補償微球
細胞通常是流式抗體單染管對照的樣本,但是當細胞數量有限,無多余細胞用于抗體單染或感興趣的表面抗原表達較低,陽性分群不明顯不足以用來調節補償時,建議選擇補償微球。
補償調節時要注意:
? 使用未染色的細胞做PMT的電壓設置
? 不要使用未染色的補償微球設置電壓
eBioscience提供兩種補償微球:OneComp eBeads與UltraComp eBeads。
微球大小和淋巴細胞相當,可連接各種熒光標記的抗體來調節補償。每滴微球中都含有兩群:一群是可以結合抗體的陽性群,一群是不會與抗體反應的陰性群。
優點:
? 使用方便,一滴即可
? 使用實驗抗體與微球有效結合調節補償,無需再用CD4分群來調節
? 細胞替代物,適應各種孵育時間,結果穩定
? 能與各種種屬和亞型的抗體反應
競爭品牌的微球是分種屬的,使用不同抗體要購買多個產品以使用
注:兔來源的抗體與微球結合力較弱,但某些還是可以使用
? 適用于各種激發光---適用于488 nm 藍光,532 nm 綠光,561 nm 黃光,633-635 nm 紅光,UltraComp eBeads尤其適用紫外 (355 nm) 或者 紫色 (405 nm) 激光器
? 微球本身信號經過優化適合補償調節
? 價格相當,有小包裝
操作步驟:
1. 準備好流式管,每種熒光抗體一個;
2. 將微球翻轉或者渦旋混勻;
3. 在每管中加入一滴微球;
4. 在管中分別加入相應的 1 test 抗體(不同抗體 1 test 的用量不同,具體參見說明書);
5. 敲擊或者渦旋混勻;
6. 2-8℃暗處孵育 15-30 分鐘;
7. 每管加 2ml 流式染色緩沖液,400-600 x g 離心 3-5 分鐘;
8. 棄上清,每管加入 0.2-0.4 mL 流式染色緩沖液;
9. 混勻后上機
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