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免疫組化步驟(ABC法)
1。4%多聚甲醛常規灌注固定,取材并置20%蔗糖溶液(4℃)中過夜。蠟塊制作。切片,貼片。0.01MKPBS清洗5min×3后;
2。加入配好的0.3%的過氧化氫甲醇溶液(甲醇80ml+0.01MKPBS 100ml+30%過氧化氫)30min,以消除內源性過氧化物酶的影響,0.01MPBS清洗5min×3;
3。加入配好的0.3% Triton X100(30% Triton X100+0.01MKPBS 100ml)30min,以增加細胞的通透性,0.01MKPBS清洗5min×3;
4。加入用血清稀釋液(牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS 100ml+疊氮納0.08g)稀釋的一抗,4℃存放24-48h;吸去抗體,0.01MKPBS洗5min×3;
5。加入0.01MKPBS稀釋的的二抗,室溫孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3;
6。加入ABC復合物之類的抗體,室溫孵育2h,0.01MKPBS洗5min×3;蒸餾水迅速沖三次;
7。加入顯色液,進行免疫組織化學顯色,時間一般不超過30min,可不時在顯微鏡下進行觀察,待細胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液,用蒸餾水迅速沖三次后加入0.01MKPBS終止反應;
8。梯度酒精脫水之后,封片,拍照。
免疫組化SP法步驟:
SP(streptavidin-perosidase)法,即鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法.
按標記物質的種類,如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等,可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標法和免疫金銀法等。按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步、三步或多步法);按結合方式可分為抗原—抗體結合,如過氧化物酶-抗過氧化物酶(PAP)法和親和連接,如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)法等,其中SP法是zui常使用的方法。
一般的sp法步驟啊,具體如下:
1.烤片,68℃,20分鐘,
2. 常規二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水;二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min
3.阻斷 滅活內源性過氧化物酶:3%H2O2 37℃孵育10min,PBS沖洗3X5min;
4. 抗原修復:置0.01M枸櫞酸緩沖液(PH 6.0)中用煮沸(95℃,15-20min),自然冷卻20min 以上,再用冷水沖洗缸子,加快冷卻至室溫,PBS沖洗3X5min。
5. 正常羊血清工作液封閉,37℃10 min,傾去勿洗.
6. 滴加一抗4℃ 冰箱孵育過夜,PBS沖洗3X5min(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照);
滴加生物素標記二抗, 37℃孵育30min, PBS沖洗3X5min;
7. 滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液,37℃孵育30min, PBS沖洗3X5min;
8. DAB/ H2O2反應染色,自來水充分沖洗后,
蘇木素復染,常規脫水,透明,干燥,封片。
免疫組化(Elivision二步法):
(1)石蠟切片置于67℃烘箱中,烘片2小時,脫蠟至水,用pH7.4的PBS沖洗三次,每次3分鐘(3×3’)。
(2)取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液,加入微波盒中,微波加熱至沸騰,將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上,放入已沸騰的緩沖液中,中檔微波處理10分鐘,取出微波盒流水自然泠卻,從緩沖液中取出玻片,先用蒸餾水沖洗兩次,之后用PBS沖洗2×3’。(注:不是所有的抗體都需要微波修復的,視具體情況而定)
(3)每張切片加1滴3% H2O2,室溫下孵育10分鐘,以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3×3’。
(4)除去PBS液,每張切片加1滴相應的*抗體(相應稀釋倍數),室溫下孵育2小時。
(5)PBS沖洗3×5’。除去PBS液,每張切片加1滴聚合物增強劑(試劑A),室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3×3’。
(6)除去PBS液,每張切片加1滴酶標抗鼠/兔聚合物(試劑B),室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3×5’
(7)除去PBS液,每張切片加1滴新鮮配制的DAB液,顯微鏡下觀察5分鐘。
(8)蘇木素復染,0.1%HCl分化,自來水沖洗,藍化,切片經梯度酒精脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封固,晾干后觀察。
注:即用型第二代免疫組化Elivision plus廣譜試劑盒,購自福州脈新生物技術開發有限公司。包括:生物素化抗兔二抗、親和素(Reagent A)、生物素-辣根過氧化物酶(Reagent B)、二氨基聯苯胺(DAB)
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