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三聚氰胺ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
閱讀：2375發(fā)布時(shí)間：2016-4-18
1.概述
此試劑盒的原理是酶聯(lián)免疫測(cè)定法，這個(gè)試劑盒可用于一切樣品中三聚氰胺的定性或定量檢測(cè)。如果需要進(jìn)一步測(cè)定可以利用HPLC,GC/MS技術(shù)。
2.安全指導(dǎo)
試劑盒標(biāo)準(zhǔn)中含有少量的三聚氰胺，另外，底物溶液中含有四甲基聯(lián)苯胺，終止液里含有稀釋的鹽酸。盡量避免不要和這些試劑接觸，如果這些試劑接觸到皮膚請(qǐng)馬上用水沖洗。
3.存儲(chǔ)和穩(wěn)定性
試劑盒應(yīng)在4–8℃保存，在使用前試劑盒內(nèi)的所有試劑都要回溫到室溫(20-25℃)在有效期內(nèi)試劑可以一直使用
4.原理
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法定量測(cè)定三聚氰胺殘留。將標(biāo)準(zhǔn)、樣品提取物和三聚氰胺酶標(biāo)記物加入到已經(jīng)包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應(yīng)。在30分鐘的孵育過程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合微孔中的三聚氰胺抗體，孵育30分鐘后洗掉微孔中所有沒有結(jié)合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標(biāo)記物。在用稀釋的洗液清洗結(jié)束后，每孔中加入清澈的底物溶液，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無(wú)色的底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的物質(zhì)。孵育20分鐘后停止此反應(yīng)，根據(jù)各孔顏色深淺進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。
5.局限性
我們已經(jīng)對(duì)可能出現(xiàn)在檢測(cè)樣品中的很多有機(jī)和無(wú)機(jī)物做了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們不和這個(gè)試劑盒發(fā)生交叉反應(yīng)。然而在樣品中也有一些易變質(zhì)的化合物，它們通過基質(zhì)影響來(lái)干擾測(cè)定，如含脂肪的食品，它們?cè)跍y(cè)定前要通過稀釋來(lái)消除一些基質(zhì)影響。在使用的過程中出現(xiàn)失誤也會(huì)影響結(jié)果，例如試劑盒存儲(chǔ)的條件、吸取液體的程序、吸取液體的不準(zhǔn)確、在發(fā)生免疫和底物反應(yīng)的過程中孵育時(shí)間不準(zhǔn)確。
6.工作數(shù)據(jù)
敏感性：三聚氰胺檢測(cè)限10μg/L，B/B0為50%時(shí)的值為150 μg/L，測(cè)定結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間是zui的。
重復(fù)性：
標(biāo)準(zhǔn)的變異系數(shù)(CVs) <10%;樣品的變異系數(shù)(CVs)<15%.
特異性：
A 試劑盒組成
1、真空包裝微孔板(8×12條)，包被有三聚氰胺多克隆抗體
2、6瓶三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液，濃度分別為0、20、50、100、200、500ng/mL(ppb)
3、1瓶7mL 三聚氰胺酶標(biāo)記物
4、5×濃縮洗液 100ml ;使用前需要使用蒸餾水以1：5的比例稀釋
5、1瓶14mL底物(TMB)
6、1 瓶14mL終止液.(注意:鹽酸,勿接觸皮膚!).
B 測(cè)試前準(zhǔn)備
微量移液器" target="_blank">微量移液器和吸頭是必須使用的，推薦使用排槍，在做同一次測(cè)試時(shí)要使用同一個(gè)盒子里的試劑和標(biāo)準(zhǔn)。
1、使用前將所有的試劑拿到室溫(19℃-25℃)。
2、從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮。置于4-8℃保存。
3、標(biāo)準(zhǔn)液，酶結(jié)合物，底物，終止液不用稀釋直接使用。
4、洗液在使用前要以1：5的比例稀釋后使用(比如：10ml洗液+40ml的蒸餾水)。
5、由于終止液中包含鹽酸拿的時(shí)候要小心。
C. 步驟
1、在對(duì)應(yīng)的微孔中加入100 μL 標(biāo)準(zhǔn)或樣品。做重復(fù)。
2、用排槍在每個(gè)孔中都加入50μL酶標(biāo)記物、然后用紙片蓋住微孔，輕輕震蕩微孔板30秒使孔中的液體混勻。
3、在室溫下孵育30分。
4、將孔里的液體倒入合適的容器中，每個(gè)微孔至少加入250μL、1×洗液，然后棄掉洗液到合適的容器中，重復(fù)洗3次。在一層厚的吸水紙上拍板，去掉殘留的洗液。
5、使用排槍在每個(gè)孔中加入100μL底物顯色液，在室溫孵育20分。盡量使其不見光。
6、每孔加入100μL終止液，板中顏色將會(huì)由藍(lán)色變?yōu)樽攸S色。
7、450nm 下讀取每個(gè)孔的吸光度值(OD)。
D. 結(jié)果評(píng)估
可以利用商業(yè)ELISA軟件程序比如Logit/Log or 4-Parameter來(lái)評(píng)價(jià)ELISA結(jié)果。也可以通過計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的%B/B0值，以%B/B0為y軸、三聚氰胺濃度為x軸作一標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品濃度可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算。當(dāng)樣品中的三聚氰胺濃度高于標(biāo)準(zhǔn)5(500μg/L)時(shí)，需要稀釋后重新再測(cè)定來(lái)獲得更的結(jié)果。
半定量結(jié)果的判定，可根據(jù)樣品的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值來(lái)判定，樣品的吸光度值低于某個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值，則說(shuō)明樣品的三聚氰胺含量大于此標(biāo)準(zhǔn)的濃度，樣品的吸光度值高于某個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值，則說(shuō)明樣品的三聚氰胺含量小于此標(biāo)準(zhǔn)的濃度。
E.還需設(shè)備
1、50μL ～200μL 單道或多道移液器和吸頭
2、微孔板洗滌機(jī)
3、振蕩器
4、蒸餾水或去離子水
5、吸水紙
6、離心機(jī)
7、450nm 濾光片的酶標(biāo)儀
此試劑盒的原理是酶聯(lián)免疫測(cè)定法，這個(gè)試劑盒可用于一切樣品中三聚氰胺的定性或定量檢測(cè)。如果需要進(jìn)一步測(cè)定可以利用HPLC,GC/MS技術(shù)。
2.安全指導(dǎo)
試劑盒標(biāo)準(zhǔn)中含有少量的三聚氰胺，另外，底物溶液中含有四甲基聯(lián)苯胺，終止液里含有稀釋的鹽酸。盡量避免不要和這些試劑接觸，如果這些試劑接觸到皮膚請(qǐng)馬上用水沖洗。
3.存儲(chǔ)和穩(wěn)定性
試劑盒應(yīng)在4–8℃保存，在使用前試劑盒內(nèi)的所有試劑都要回溫到室溫(20-25℃)在有效期內(nèi)試劑可以一直使用
4.原理
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法定量測(cè)定三聚氰胺殘留。將標(biāo)準(zhǔn)、樣品提取物和三聚氰胺酶標(biāo)記物加入到已經(jīng)包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應(yīng)。在30分鐘的孵育過程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合微孔中的三聚氰胺抗體，孵育30分鐘后洗掉微孔中所有沒有結(jié)合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標(biāo)記物。在用稀釋的洗液清洗結(jié)束后，每孔中加入清澈的底物溶液，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無(wú)色的底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的物質(zhì)。孵育20分鐘后停止此反應(yīng)，根據(jù)各孔顏色深淺進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。
5.局限性
我們已經(jīng)對(duì)可能出現(xiàn)在檢測(cè)樣品中的很多有機(jī)和無(wú)機(jī)物做了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們不和這個(gè)試劑盒發(fā)生交叉反應(yīng)。然而在樣品中也有一些易變質(zhì)的化合物，它們通過基質(zhì)影響來(lái)干擾測(cè)定，如含脂肪的食品，它們?cè)跍y(cè)定前要通過稀釋來(lái)消除一些基質(zhì)影響。在使用的過程中出現(xiàn)失誤也會(huì)影響結(jié)果，例如試劑盒存儲(chǔ)的條件、吸取液體的程序、吸取液體的不準(zhǔn)確、在發(fā)生免疫和底物反應(yīng)的過程中孵育時(shí)間不準(zhǔn)確。
6.工作數(shù)據(jù)
敏感性：三聚氰胺檢測(cè)限10μg/L，B/B0為50%時(shí)的值為150 μg/L，測(cè)定結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間是zui的。
重復(fù)性：
標(biāo)準(zhǔn)的變異系數(shù)(CVs) <10%;樣品的變異系數(shù)(CVs)<15%.
特異性：
A 試劑盒組成
1、真空包裝微孔板(8×12條)，包被有三聚氰胺多克隆抗體
2、6瓶三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液，濃度分別為0、20、50、100、200、500ng/mL(ppb)
3、1瓶7mL 三聚氰胺酶標(biāo)記物
4、5×濃縮洗液 100ml ;使用前需要使用蒸餾水以1：5的比例稀釋
5、1瓶14mL底物(TMB)
6、1 瓶14mL終止液.(注意:鹽酸,勿接觸皮膚!).
B 測(cè)試前準(zhǔn)備
微量移液器" target="_blank">微量移液器和吸頭是必須使用的，推薦使用排槍，在做同一次測(cè)試時(shí)要使用同一個(gè)盒子里的試劑和標(biāo)準(zhǔn)。
1、使用前將所有的試劑拿到室溫(19℃-25℃)。
2、從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮。置于4-8℃保存。
3、標(biāo)準(zhǔn)液，酶結(jié)合物，底物，終止液不用稀釋直接使用。
4、洗液在使用前要以1：5的比例稀釋后使用(比如：10ml洗液+40ml的蒸餾水)。
5、由于終止液中包含鹽酸拿的時(shí)候要小心。
C. 步驟
1、在對(duì)應(yīng)的微孔中加入100 μL 標(biāo)準(zhǔn)或樣品。做重復(fù)。
2、用排槍在每個(gè)孔中都加入50μL酶標(biāo)記物、然后用紙片蓋住微孔，輕輕震蕩微孔板30秒使孔中的液體混勻。
3、在室溫下孵育30分。
4、將孔里的液體倒入合適的容器中，每個(gè)微孔至少加入250μL、1×洗液，然后棄掉洗液到合適的容器中，重復(fù)洗3次。在一層厚的吸水紙上拍板，去掉殘留的洗液。
5、使用排槍在每個(gè)孔中加入100μL底物顯色液，在室溫孵育20分。盡量使其不見光。
6、每孔加入100μL終止液，板中顏色將會(huì)由藍(lán)色變?yōu)樽攸S色。
7、450nm 下讀取每個(gè)孔的吸光度值(OD)。
D. 結(jié)果評(píng)估
可以利用商業(yè)ELISA軟件程序比如Logit/Log or 4-Parameter來(lái)評(píng)價(jià)ELISA結(jié)果。也可以通過計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的%B/B0值，以%B/B0為y軸、三聚氰胺濃度為x軸作一標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品濃度可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算。當(dāng)樣品中的三聚氰胺濃度高于標(biāo)準(zhǔn)5(500μg/L)時(shí)，需要稀釋后重新再測(cè)定來(lái)獲得更的結(jié)果。
半定量結(jié)果的判定，可根據(jù)樣品的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值來(lái)判定，樣品的吸光度值低于某個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值，則說(shuō)明樣品的三聚氰胺含量大于此標(biāo)準(zhǔn)的濃度，樣品的吸光度值高于某個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值，則說(shuō)明樣品的三聚氰胺含量小于此標(biāo)準(zhǔn)的濃度。
E.還需設(shè)備
1、50μL ～200μL 單道或多道移液器和吸頭
2、微孔板洗滌機(jī)
3、振蕩器
4、蒸餾水或去離子水
5、吸水紙
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