基因組測序中的“暗區"和未知區域問題

由于各種原因，所有基因組都包含“難以測序"的區域：

·測序深度不足

·繪圖質量差

·分階段

·病毒、轉基因和 CRISPR 編輯的未知整合位點

長基因測序的必要性

基因組編輯在研究、醫療保健和農業方面有著強大的應用。然而，基因組編輯可能導致的各種分子反應事件的范圍被低估了，而且該技術在目標位點內外仍然無法預測。這對于為治療性基因編輯、農業和其他應用提供安全方法具有相當大的影響。預測和驗證基因組編輯的結果對于所有應用的成功至關重要。

Cas9 誘導的雙鏈斷裂導致一系列預期和意外的結果。 zui 終的編輯結果導致小的 insert、刪除或染色體易位或不完整的模板整合。

通過各種努力，我們已經采用了多種方法來驗證正確的基因編輯并確保未發生針對目標的意外編輯事件。 zui 常用的分子方法是通過 Sanger直接DNA 測序或 PCR擴增子的 NGS ，其大小通常小于 1000 bp。

其他常見方法包括 T7核酸內切酶1 (T7E1) 錯配檢測分析、通過分解跟蹤 insert 缺失 (TIDE) 分析和通過擴增子分析 (IDAA) 檢測 insert 缺失、clone PCR 擴增子然后測序，但偶爾也包括全基因組測序(WGS)、陣列比較基因組雜交 (CGH)、Southern 印跡、Fiber-FISH 和 FISH。

大多數情況下，這些方法僅提供有關基因編輯位點周圍有限區域的信息，不會捕獲來自 CRISPR/Cas誘變效應的整個序列，尤其是不會檢測更大的缺失。為此Kosicki 等人在Nat. Biotechnol上發表的《Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements》論文，強調了將分子分析擴展到包括 CRISPR-Cas9 誘導的 DSB 位點周圍的幾千堿基的重要性，并展示了長讀長測序如何可以高分辨率的分析基因編輯的準確性。

長讀長測序可以解決許多這些挑戰，但在常規實驗室分析中大規模應用不切實際且成本高昂。

Xdrop高保真長基因文庫制備儀

Samplix 的 Xdrop™ 儀器可以捕獲基因組 DNA 的長 (>100 kb) 區域。 使用 Xdrop 為科學家提供了目標富集的經證實的好處（減少時間、成本和數據分析），與已建立的目標富集方法相比具有額外的優勢：

解鎖基因組的任何部分

·以僅 100-200 bp 的序列信息為目標的任何區域

快速適應新目標

·識別和捕獲新目標，在 4-5 天內準備好進行測序

從您的長讀儀器中獲得更多收益

·測序能力集中在您感興趣的區域

減少測序偽影

·使用無 PCR、無偏差的目標擴增方法

Samplix Xdrop™用于富集長基因組DNA 片段，以通過長讀長和短讀長測序分析 CRISPR-Cas9 編輯細胞中的基因型和等位基因狀態 。在論文《Verification of CRISPR editing and finding transgenic inserts by Xdrop Indirect sequence capture followed by short- and long- read sequencing》中，研究人員通過Xdrop技術在一組 CRISPR 修飾的誘導多能干 (iPS) 細胞系中檢測到 CRISPR-Cas9 誘導的意外基因編輯。 盡管使用其他幾種互補方法進行了全面分析，但早期驗證 CRISPR 編輯的嘗試并未檢測到這些意外編輯。

在這項研究中，他們還證明用于評估 CRISPR-Cas9 基因組編輯事件的基于 PCR 的標準程序無法提供足夠準確的驗證。CRISPR 編輯的驗證應基于對更大區域的檢查。

Xdrop方法所檢測序列的位置可能與主要感興趣區域（如基因編輯位點）相距 5-10 千堿基 (kb) 或更遠。

其實驗過程是在將高分子量 (HMW) DNA 、PCR 試劑和引物分配到雙乳液液滴內并進行反應后，含有目標 DNA 的液滴通過液滴 PCR識別，然后用 DNA 嵌入熒光染料進行染色。

只有含有來自感興趣區域 (ROI) 的 DNA 的液滴才會產生檢測序列擴增子并發出熒光。由于雙乳液液滴的大小和組成，這些可以在標準流式細胞儀細胞的分選儀器上進行分類，以富集熒光液滴。

然后分離含有長 DNA 片段的液滴，并通過液滴中的單分子多重置換擴增(dMDA) 進行擴增。dMDA 的擴增能力能夠從 6 pg 的輸入 DNA 中產生約 1.5 μg 的擴增 DNA，并且對大于 5 kb 的分子 zui 有效。由此產生的富集 DNA 與短讀長和長讀長測序平臺兼容。

Xdrop間接序列捕獲方法可采用距基因編輯位點 5–10 kb 或更遠的距離設計的引物，它在高深度測序提供了大約 100 kb 長的區域的序列讀取覆蓋。這允許對基因編輯站點周圍區域中潛在的意外編輯進行完整調查。Xdrop技術展示了如何在事先不了解其基因組整合的情況下也能夠識別轉基因 insert 位點。

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