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本文作者：崔琴琴浙江大學腦科學與腦醫學學院白戈課題組
腓骨肌萎縮癥（Charcot-Marie-Tooth neuropathies，CMT）是一組臨床上常見的周圍神經遺傳病，發病率約為1/2500。根據致病基因的不同， CMT可分為幾十種不同的亞型。就CMT患者總數而言，在全國范圍內是一個非常龐大的數字，然而具體到某些亞型的患者數量卻非常稀少，因此CMT被收錄到國家《第一批罕見病名錄》。長久以來令人困惑的是，這幾十種CMT致病蛋白在細胞中的定位和生理功能各異，似乎沒有任何明顯的共性，然而這些突變蛋白卻會導致CMT患者表現出非常相似的臨床癥狀。這個被稱之為“疾病遺傳異質性”的謎團長期以來一直困擾著廣大神經科學家和臨床工作者。有沒有可能不同的致病蛋白最后通過一個“殊途同歸”的共同機制引發相似癥狀？在過去幾十年的研究中，領域內逐漸形成了一個共識：大多數神經系統疾病的發生都是遺傳因子和環境應激因子共同作用的結果[1, 2]。當細胞面臨各種不良環境刺激時（如營養缺乏、高溫、輻射等），細胞內一個重要的應激機制就是形成應激顆粒（Stress granule，SG），SG的形成可以避免蛋白的錯誤翻譯，有效地組織利用細胞中各種信號分子和能量資源，使細胞更好地應對環境中的不良刺激，提高細胞存活率[3, 4]。近年來越來越多的證據表明，SG在多種神經退行性疾病中扮演了非常關鍵的角色，其功能主要是與肌萎縮側索硬化相關疾病中蛋白沉淀的形成相關[5-7]，而CMT是不產生蛋白沉淀的周圍神經病，應激顆粒是否參與到CMT疾病中尚未有研究[8-10]。
2023年2月3日，浙江大學醫學院腦科學與腦醫學學院白戈課題組與合作者在Cell雜志( IF=66.850 (2022) / JCR分區: Q1 )以封面文章形式在線發表了題為“Diverse CMT2 Neuropathies are Linked to Aberrant G3BP Interactions in Stress Granules“ 的研究論文。該工作發現雖然在正常生理狀態下不同CMT致病蛋白在細胞中的定位各異，但在應激狀態下這些CMT致病蛋白會表現出相同的細胞定位，進入應激顆粒中并與其核心蛋白G3BP發生異常互作，引起應激顆粒異常，使得周圍神經應對環境不良刺激的能力下降，從而導致周圍神經病的發生。
該研究首先使用浙江大學醫學院公用技術平臺Olympus FV3000激光共聚焦顯微鏡（FV4000激光共聚焦現已發布），在HeLa細胞、雞胚運動神經元和小鼠原代培養運動神經元中確定了導致CMT2D亞型的GlyRS蛋白能夠在應激狀態下進入到應激顆粒中（圖1），同時利用該顯微鏡的時間序列和FRAP成像模塊獲得數據揭示了GlyRS致病蛋白對神經元生長長度影響及GlyRS致病蛋白對應急顆粒動態性的影響。
圖1. GlyRS蛋白在應激下定位到SG中。A-C：HeLa細胞中野生型和突變型的GlyRS蛋白在應激狀態下進入到SG中，并與SG核心蛋白G3BP1發生共定位。D-F：在雞胚脊髓運動神經元中驗證體內GlyRS與G3BP1蛋白共定位。G-I：在小鼠原代培養運動神經元中確定了內源性GlyRS與G3BP1蛋白發生共定位。
隨后研究人員通過活細胞熒光成像、鄰近標記、定量蛋白質譜、STORM超分辨成像等技術發現，GlyRS突變蛋白與G3BP的異常相互作用不會影響SG組裝-解聚的動態變化，卻會顯著干擾以G3BP為核心的SG蛋白網絡，導致大量非SG組分異常滯留在SG中，從而擾亂了細胞正常的應激反應，導致運動神經元抵御外界不良環境刺激的能力明顯下降，更易發生軸突退變（圖2）。
研 究 人 員 還 進 一 步 鑒 定 出 了 GlyRS 突 變 蛋 白 與 G3BP 的 結 合 位 點 位 于 其 “ 內 在 無 序 區 ”（Intrinsically disordered region, IDR），通過破壞二者的異常結合，能夠消除GlyRS突變蛋白對SG的干擾，改善運動神經元抵抗不良環境刺激的能力，有效緩解CMT2D小鼠模型的疾病癥狀 （圖2）。
圖2. 不同CMT2蛋白的共性致病機制。
最后，研究人員還發現這個機制可以進一步擴展到其他CMT2亞型。通過對20幾種不同類型CMT2致病蛋白進行測試，研究人員發現這些原本定位在細胞內不同部位的蛋白質，在應激條件下大部分都可以進入SG并且與G3BP發生異常相互作用，引起SG異常，導致運動神經元應對環境不良刺激的能力下降。這些發現表明應激顆粒異常很可能是介導不同亞型CMT的共性致病機制（圖2）。
綜上，該工作揭示了應激顆粒異常是介導不同亞型CMT的共同致病機制，為針對多亞型CMT的廣譜治療藥物的開發提供了重要理論基礎，也為其他疾病遺傳異質性的機制研究提供了新的思路。
本文中多色熒光標記的細胞圖像都是采用Olympus激光掃描共聚焦FV3000拍攝。FV3000的全真光譜技術可以自由調整標記熒光信號的收集波段，并有效防止不同標記之間的熒光串擾，幫助用戶獲取更加真實可靠的數據。另外，本文還利用FV3000觀察了活細胞中的G3BP1液滴以及通過FRAP實驗驗證了其相分離特性。FV3000靈活高效的龍卷風光刺激模式以及追蹤運動中的液滴并分析其漂白區域熒光強度變化的功能，是幫助用戶進行相分離研究的利器。
浙江大學雙腦中心、浙江大學醫學院腦科學與腦醫學學院白戈研究員與中國科學院分子細胞科學卓越創新中心李勁松院士為本文的共同通訊作者。博士后崔琴琴、畢洪運、呂占云，博士生武琪貴、華劍鋒、谷博凱為本文共同第一作者，博士后霍嬋娟、唐明敏等也為本研究做出重要貢獻。本研究還得到了劉華清、楊培國、金志剛、吳志英、章永登、沈承勇、盛能印等教授的大力支持，并得到了段樹民院士、胡海嵐、景乃禾、李黨生、唐北沙、張宏、楊兵、蔣超、張軻、孫啟明、彭廣敦、郭天南、張如旭、劉聰、陳萬金、趙國華、Sam Pfaff（Salk Institute）、Xiang-Lei Yang（TSRI）等教授的指導和幫助。該研究主要受國家自然科學基金委“原創探索計劃”、“器官衰老與器官退行性變化的機制”重大研究計劃、科技創新2030重大項目等資助。
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