線性PEI轉(zhuǎn)染試劑- KE1082

用途：用于轉(zhuǎn)染核酸到哺乳動物細(xì)胞

產(chǎn)品編號：KE1082

包裝規(guī)格：0.1ml

儲存條件：4℃

產(chǎn)品概述 ：

線性PEI轉(zhuǎn)染試劑是一種陽離子聚合物，它能與核酸形成復(fù)合物，并使該復(fù)合 物進入哺乳動物細(xì)胞。線性PEI轉(zhuǎn)染試劑廣泛適用于常見細(xì)胞系，如 HEK-293、HEK293T、 Hep G2、Hela、CHO-K1、COS-1、COS-7、NIH/3T3 和 Sf9 等。該試劑即使在有血清存在的情況下， 它仍然能高效的將核酸導(dǎo)入細(xì)胞。

線性PEI轉(zhuǎn)染試劑具有如下優(yōu)點：

*的轉(zhuǎn)染效率

重組蛋白的高表達(dá)水平

與含血清的培養(yǎng)基相兼容

低細(xì)胞毒性，易于操作

質(zhì)量控制：

每批次線性PEI轉(zhuǎn)染試劑均經(jīng)過轉(zhuǎn)染測試。將 eGFP 表達(dá)質(zhì)粒用 PEI轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)入亞融合狀態(tài)的293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 16 h 后， 超過 95%的細(xì)胞表達(dá) eGFP。

?線性PEI轉(zhuǎn)染試劑- KE1082注意事項 ：

一．質(zhì)粒質(zhì)量，請務(wù)必使用高質(zhì)量轉(zhuǎn)染級無內(nèi)毒素質(zhì)粒。通過 260 nm 光吸收測定 DNA 濃度，260 nm / 280 nm 比值確定 DNA 純度（比值應(yīng)該在 1.8~2.0 的范圍之內(nèi)）。如有可能，請通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒的完整性。

二．細(xì)胞條件，使用適當(dāng)保存和經(jīng)常傳代的健康細(xì)胞。確保培養(yǎng)基沒有被細(xì)菌、真菌或支原體污染。如果細(xì)胞是近期復(fù)蘇的液氮凍存細(xì)胞，請在轉(zhuǎn)染前至少傳代兩次。建議使用GIBCO公司血清培養(yǎng)細(xì)胞。

瞬時轉(zhuǎn)染方法

• 接種細(xì)胞， 轉(zhuǎn)染前一天，用膠原酶消化細(xì)胞并計數(shù)（不建議用胰酶）。調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞鋪入細(xì)胞培養(yǎng)的器皿，每個孔置入的細(xì)胞量應(yīng)能使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合度達(dá)到 70~80%。

二．準(zhǔn)備 DNA-PEI 復(fù)合物， DNA、PEI 試劑和稀釋劑在進行以下步驟前需先使其升至室溫。用 Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他適合的無蛋白培養(yǎng)基稀釋適量 DNA。用同樣的培養(yǎng)基稀釋 PEI 試劑。每 1 μg DNA 需用 2-5 μL 線性PEI轉(zhuǎn)染試劑。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液 的試管，一邊將稀釋的線性PEI轉(zhuǎn)染試劑滴加至試管中（注意：請勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置 10~25 min 以形成 DNA-PEI復(fù)合物。當(dāng)溶液體積較大時，請用圓底聚丙烯管，例如 Falcon 5 mL /14 mL 離心管。

三．轉(zhuǎn)染細(xì)胞，直接向每個孔中加入 DNA-PEI復(fù)合物并輕輕渦旋培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿。在無血清條件下轉(zhuǎn)染時，去除生長培養(yǎng)基，替換成無血清培養(yǎng)基，然后滴DNA-PEI復(fù)合物。轉(zhuǎn)染 3 h 后，添加1/2體積的包含 30%血清的生長培養(yǎng)基。

四．孵育細(xì)胞和分析結(jié)果，在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細(xì)胞至可以分析檢測。轉(zhuǎn)染后快 7 h 即可檢測到轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)。 請自行確定適合檢測時間。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法

一．接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天，用胰酶消化細(xì)胞并計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞鋪入細(xì)胞培養(yǎng)的器皿，每個孔置入的細(xì)胞量應(yīng)能使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合度達(dá)到 70~80%。

二．準(zhǔn)備 DNA-PEI 復(fù)合物： DNA、PEI 試劑和稀釋劑在進行以下步驟前需先使其升至室溫。用 Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他適合的無蛋白培養(yǎng)基稀釋適量 DNA。用同樣的培養(yǎng)基稀釋 PEI 試劑。每 1 μg DNA 需用 2-5 μL 線性PEI轉(zhuǎn)染試劑。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液 的試管，一邊將稀釋的線性PEI轉(zhuǎn)染試劑滴加至試管中（注意：請勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置 10~25 min 以形成 DNA-PEI復(fù)合物。當(dāng)溶液體積較大時，請用圓底聚丙 烯管，例如 Falcon  5 mL /14 mL 離心管。

三．轉(zhuǎn)染細(xì)胞，直接向每個孔中加入 DNA-PEI復(fù)合物并輕輕渦旋培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿。在無血清條件下轉(zhuǎn)染時，去除生長培養(yǎng)基，替換成無血清培養(yǎng)基，然后滴DNA-PEI復(fù)合物。轉(zhuǎn)染 3 h 后，添加1/2體積的包含 30%血清的生長培養(yǎng)基。

四．孵育細(xì)胞和分析結(jié)果： 在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細(xì)胞至可以分析檢測。轉(zhuǎn)染后快 7 h 即可檢測到轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)。

五．轉(zhuǎn)染 24 h 后，將細(xì)胞傳代至新鮮的生長培養(yǎng)基中（將細(xì)胞稀釋 10 倍 以上），在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃孵育過夜。第二天加入與轉(zhuǎn)染抗性基因相匹配的篩選藥物。約 1~2 周可篩選到耐藥性克隆，在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長培養(yǎng)基。

特別提醒

一． 對于某些類型的細(xì)胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前兩天鋪板可顯著提高轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)水平。如果選擇轉(zhuǎn)染前兩天鋪板，可適當(dāng)降低鋪板密度，以確保轉(zhuǎn)染時細(xì)胞 的匯合度仍為 70~80%。

二．對于接觸抑制敏感的細(xì)胞，可適當(dāng)降低鋪板密度。

三． 即使在有蛋白（如 10%的血清）存在的情況下，DNA-PEI復(fù)合物仍能轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但是 DNA-PEI復(fù)合物必須在無蛋白存在的條件下形成。我們推薦使用 Opti-MEM ITM 培養(yǎng)基以達(dá)到轉(zhuǎn)染效率。其他的無蛋白培養(yǎng)基則需測試與線性PEI轉(zhuǎn)染試劑的兼容性。

四．對大多數(shù)細(xì)胞而言，每1ug使用3.0ulKingmorn® DNA transfection reagent轉(zhuǎn)染試劑都能獲得較高轉(zhuǎn)染效率。使用者也可嘗試每 1 ugDNA 使用 1~4 ul體積線性PEI轉(zhuǎn)染試劑進行優(yōu)化。

五．參考用量