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一、實驗目的

學習和掌握外源基因?qū)胝婧思毎闹饕椒?mdash;—脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進入的一般性方法，觀測外源蛋白的表達（綠色熒光蛋白），為染色準備實驗材料。

二、實驗原理

上圖所示是脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進入細胞的一般過程。

外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導法和病毒介導法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質(zhì)粒進入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進入細胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大；病毒法的前期準備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響；所以現(xiàn)在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細胞密度以及轉(zhuǎn)染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對于效率的提高有巨大的作用。

上圖是本次實驗采用的脂質(zhì)體中陽離子組分的結(jié)構(gòu)的示意圖。

本次實驗采用的脂質(zhì)體是promega公司的TransFast脂質(zhì)體試劑，它是一種陽離子脂質(zhì)體和中性脂質(zhì)體的混合物，是對于本次實驗中采用的293T細胞優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑。

三、實驗材料與器材

1、材料

293T細胞
MyoD表達質(zhì)粒和EGFP表達質(zhì)粒
DMEM培養(yǎng)基
鏈霉素/青霉素（雙抗）
FCS（小牛血清）
PBS（磷酸鹽緩沖溶液）
胰酶/EDTA消化液
轉(zhuǎn)染試劑（TransFast）

2、器材

20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭
酒精燈
廢液缸
血球計數(shù)板
渦旋振蕩器
恒溫水浴箱
臺式離心機
35mm培養(yǎng)皿
轉(zhuǎn)染管
15ml離心管
觀察用倒置顯微鏡
熒光顯微鏡和CCD

四、 實驗步驟

1、細胞傳代

（1） 試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒（以上物品均需高壓滅菌），酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養(yǎng)皿，離心管。

（2） 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。

（3） 用Tip頭加入1ml Trypsin液，消化1分鐘（37℃，5%CO₂ ）。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細胞*從壁上脫落下來為止。

（4） 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。

（5） 用Tip頭多次吹吸，使細胞*分散開。

（6） 將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。

（7） 用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇0.8X10⁶個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。

（8） 將合適體積*培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。

（9） 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。

2、細胞轉(zhuǎn)染

（1）轉(zhuǎn)染試劑的準備

A. 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

B.震蕩后將試劑放在-20℃保存，使用前還需震蕩，。

（2） 選擇合適的混合比例（1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量）來轉(zhuǎn)染細胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。

（3） 將混合液在室溫放置10-15分鐘。

（4）  吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。

（5） 加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。

（6） 到時后，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液，之后加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。

3、第二次細胞傳代

（1） 在轉(zhuǎn)染后24小時，觀察實驗結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。

（2） 再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X10⁵個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞重新粉入培養(yǎng)皿中。

（3） 在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。