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因此，我們重點研究了 AT101誘導(dǎo)的 BNIP3在 MPNST 細胞中的功能作用。為了確定 BNIP3是否促進 AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細胞死亡，我們通過用 BNIP3siRNA 或?qū)φ辗前邢?span> siRNA 轉(zhuǎn)染 T265-2c 細胞來瞬時敲低 BNIP3表達。我們發(fā)現(xiàn) BNIP3，而不是對照，siRNA 有效地減弱 BNIP3的表達(圖3D)。然后，我們用10或15μMAT101處理 T265-2c 細胞，并比較 BNIP3siRNA 轉(zhuǎn)染的細胞中的細胞活力與用對照寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細胞中的細胞活力。我們發(fā)現(xiàn)，與用非靶向 siRNA 轉(zhuǎn)染的細胞相比，在 BNIP3敲低的細胞中，AT101誘導(dǎo)的細胞死亡顯著減弱(圖3E)。我們得出結(jié)論，BNIP3是 AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細胞毒性的重要介質(zhì)。 AT101引起 HIF-1α 蛋白的積累，其調(diào)節(jié) BNIP3表達 BNIP3是 HIF-1α 的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，已顯示調(diào)節(jié) BNIP3表達以響應(yīng)缺氧[40]和神經(jīng)酰胺處理的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞[41]。HIF-1α 可以在缺氧條件下和其他非缺氧刺激后積累[42]。AT101或棉酚處理對 HIF-1α 蛋白水平的積累尚未見報道。因此，我們檢測了 AT101處理的 MPNST 細胞中 HIF-1α 的蛋白水平。我們發(fā)現(xiàn) AT101處理增加了 T265-2c 細胞中 HIF-1α 蛋白的水平(圖4A) ，而沒有伴隨的 HIF-1α mRNA 的增加(圖4B)。我們還發(fā)現(xiàn)，在 AT101處理后，HIF-1α 蛋白在細胞核內(nèi)積累(圖4C) ，在那里它被證明具有轉(zhuǎn)錄因子的功能。來確定是否

BNIP3是 HIF-1α 的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，已顯示其調(diào)節(jié)缺氧反應(yīng)中的 BNIP3表達[40]和用神經(jīng)酰胺處理的膠質(zhì)瘤細胞[41]。HIF-1α 可以在缺氧條件下和其他非缺氧刺激后積累[42]。AT101或棉酚處理對 HIF-1α 蛋白水平的積累尚未見報道。因此，我們檢測了 AT101處理的 MPNST 細胞中 HIF-1α 的蛋白水平。我們發(fā)現(xiàn) AT101處理增加了 T265-2c 細胞中 HIF-1α 蛋白的水平(圖4A) ，而沒有伴隨的 HIF-1α mRNA 的增加(圖4B)。我們還發(fā)現(xiàn)，在 AT101處理后，HIF-1α 蛋白在細胞核內(nèi)積累(圖4C) ，在那里它被證明具有轉(zhuǎn)錄因子的功能。為了確定 HIF-1α 是否轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) BNIP3表達，我們瞬時敲低了 T265-2c 細胞中的 HIF-1α 表達(圖4D) ，并檢查了 AT101處理后對 BNIP3表達的影響。我們發(fā)現(xiàn) HIF-1αsiRNA 而不是對照 siRNA 抑制 AT101處理的細胞中 BNIP3的表達(圖4E)。我們的結(jié)論是，AT101導(dǎo)致 HIF-1α 蛋白在 MPNST 細胞中的積累，從而促進 BNIP3的表達。

圖4。AT101通過 HIF-1α 積累刺激 BNIP3表達。用 AT101處理的 T265-2c 細胞(10μM，24小時)表現(xiàn)出 HIF-1α 蛋白水平增加(A) ，但是 AT101處理的 MPNST 細胞相對于未處理的細胞不顯示 HIF-1αmRNA 水平(B)的顯著變化。AT101導(dǎo)致 T265-2c 細胞核部分 HIF-1α 蛋白水平升高(C)。相對于用非靶 siRNA 轉(zhuǎn)染的細胞，用 AT101處理后，用 HIF-1αsiRNA 轉(zhuǎn)染的 T265-2c 細胞顯示 HIF-1α 蛋白(D)和 BNIP3蛋白表達(E)的水平降低。# = 不重要。

AT101通過細胞內(nèi)鐵螯合作用引起 HIF-1α 的積累除了缺氧之外，某些非缺氧刺激如雌激素、胰島素和表皮生長因子[43]-[45]可以在常氧條件下誘導(dǎo) HIF-1α 的表達。有趣的是，槲皮素和高良姜素等多酚也可以誘導(dǎo) HIF-1α 蛋白的積累，而不增加 HIF1-α mRNA 水平[46] ，正如我們在 AT101中觀察到的。這種作用被認為是通過細胞內(nèi)鐵螯合作用介導(dǎo)的[46] ，[47]。因此，我們接下來詢問鐵是否參與 AT101誘導(dǎo)的 HIF-1α 積累，BNIP3表達和 MPNST 細胞死亡。為了解決 AT101是否干擾細胞內(nèi)鐵水平，我們評估了用 AT101處理的 MPNST 細胞中運鐵蛋白受器1(TfR1)和鐵蛋白(重鏈)的蛋白質(zhì)水平。TfR1是一種載體蛋白，促進鐵轉(zhuǎn)運進入細胞[48]。TfR1的表達在轉(zhuǎn)錄后受到調(diào)控，并與細胞內(nèi)鐵濃度呈負相關(guān)。此外，鐵蛋白重鏈催化細胞內(nèi)鐵儲存的第一步，其蛋白質(zhì)水平對應(yīng)于細胞內(nèi)鐵水平[48]。我們發(fā)現(xiàn) AT101處理增加了 T265-2c 和90-8細胞中的 TfR1蛋白水平并降低了鐵蛋白重鏈蛋白水平，并且當(dāng)培養(yǎng)基補充檸檬酸鐵(100μM)作為鐵離子的來源時，這些 AT101效應(yīng)被阻斷(圖5A)。為了確定鐵螯合是否是 AT101誘導(dǎo) HIF-1α 積累以及隨后的 BNIP3和自噬的機制，我們評估了補鐵對這些事件的影響。在細胞培養(yǎng)基中加入檸檬酸鐵消除了由 AT101誘導(dǎo)的 HIF-1α，BNIP3和 LC3II 的積累(圖5B)。為了進一步評估補鐵對 AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細胞毒性的功能相關(guān)性，我們評估了添加檸檬酸鐵后的細胞活力。

我們發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)基的鐵補充對 T265-2c 和90-8細胞中 AT101誘導(dǎo)的細胞毒性提供了顯著的保護(圖5C，D)。AT101對 MPNST 細胞的這些作用與 DFO (一種著名的鐵螯合劑)的作用相似。向細胞培養(yǎng)基中添加檸檬酸鐵不能影響 ABT737的細胞毒作用，ABT737是 T265-2c 和90-8細胞上結(jié)構(gòu)上不同的 BH3模擬物(圖5E，F)。

圖5。補鐵保護 MPNST 細胞免受 AT101誘導(dǎo)的細胞毒性。 AT101(15μM，24小時)處理增加了 MPNST 細胞中的運鐵蛋白受器1(TfR1)蛋白水平并降低了鐵蛋白水平(A) ，這通過向培養(yǎng)基中加入檸檬酸鐵逆轉(zhuǎn)。補充檸檬酸鐵(100μM)的培養(yǎng)基也消除了在 T265-2c 和90-8細胞(C，D)中 AT101誘導(dǎo)的 HIF-1α，BNIP3和 LC3II 蛋白表達(B)和細胞毒性。通過用檸檬酸鐵(100μM)(E，F)補充培養(yǎng)基，MPNST 細胞不能從 ABT737(15μM)誘導(dǎo)的細胞毒性中拯救。DFO (50μM，24小時)作為鐵螯合陽性對照。* p-value < 0.05.# = 不重要。

討論 AT101是棉酚的修飾對映體，一種天然存在的抗凋亡 BCL-2蛋白的小分子拮抗劑[49] ，[50]。AT101及其母體化合物棉酚已被證明在廣泛的癌細胞中具有細胞毒性作用，AT101目前正在進行幾種癌癥的 II 期臨床試驗[51]-[54]。除了通過計算機輔助分子建模，核磁共振成像和熒光偏振測定被鑒定為 BH3模擬物外，其他研究已經(jīng)證明棉酚可以抑制 DNA 合成[19] ，細胞能量代謝[55] ，蛋白激酶C [21] ，端粒酶[57]和人類有絲分裂驅(qū)動蛋白，EG5[58]。除了這些作用之外，棉酚還可以調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)[20]和 TGF-β1信號傳導(dǎo)[59]。在結(jié)構(gòu)研究表明棉酚是一種 BH3模擬物后，發(fā)現(xiàn)棉酚可以通過增加活性氧類，激活 p53[61]和抑制 NF-κB 活性來激活內(nèi)在的凋亡途徑[62]。此外，棉酚可以增加促凋亡 BH3-only 蛋白的表達[23] ，并誘導(dǎo) BCL-2中的構(gòu)象改變，使其促凋亡[63]。由于棉酚細胞毒作用的機制可能受到癌細胞和其他腫瘤特異性因素的遺傳特征的影響，鑒定 AT101細胞毒作用的相關(guān)機制對于評估其在 MPNST 治療中的潛在用途是重要的。