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Q1. 細胞如何貼壁或者固定好?
這是第一步,也是基礎和關鍵的一步,這是基礎,基礎不好,后面一切都是白搭。
對于貼壁細胞: 先將潔凈的爬片片在 70%乙醇中進行浸泡處理,然后用干凈無菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中,用無菌 PBS 洗去殘留的乙醇。待細胞接近長成單層后取出蓋玻片(一般都是過夜培養(yǎng))操作小心,防止細胞脫片。
對于懸浮細胞: 如果能像貼壁細胞一樣,那就好了。傳統(tǒng)這是一個痛點待解決,其實新的方法就是使用靶點科技(Biotarget)的懸浮細胞免疫熒光專用玻片。讓懸浮細胞簡單四步,就能像貼壁細胞一樣固定好,主要是,細胞還是活的,還可以刺激。
Q2. 如何避免多種染色互串?
*細胞不能鋪的太密,細胞稀釋一下,濃度不能太高,盡可能用大體積來鋪細胞。太密就導致一抗結合蛋白增多,更容易出現(xiàn)非特異性染色,且細胞太密,顯微鏡拍照出來的效果就會很一般,一般6孔板滿孔的貼壁細胞,取1/8的量鋪到帶有爬片的12孔板里,大概12小時后,細胞密度就剛剛好。懸浮細胞,直接用靶點科技的懸浮細胞免疫熒光專用玻片就行。雙抗體染色時可不用活細胞染核液(Hoechst),也就是不要最開始染核,放到最后封片時,用DAPI染,DAPI濃度不要過高,核很容易被染色,低濃度染色即可。
*支原體清除后再做IF。用狀態(tài)好,未被污染的細胞去做IF,狀態(tài)好的細胞伸展很開,染色效果也更好,若細胞支原體污染,可能會產(chǎn)生背景臟,圖像不完整等現(xiàn)象,非特異性染色嚴重且去不掉,染核染抗體都會被染上亂七八糟的東西。
*一抗?jié)舛鹊膯栴}。雙抗體染色若外轉質粒,可染標簽抗體,標簽抗體更特異且使用濃度低,一般都在1:500左右;若染內源性蛋白,濃度可1:200,做之前記得看下抗體說明書該抗體是否可以做IF;4度過夜染效果更好,一抗可回收,負20保存,大概可用3次,根據(jù)抗體靈敏度決定使用次數(shù);雙抗體IF,一定要用不同來源的的抗體,一個用鼠,一個用兔,最好不要雙鼠或者雙兔的。
*二抗:常溫孵育1~2h,避光,避開同屬性的二抗,洗滌一抗可用pbs,洗滌二抗可以用tbst,多加一些吐溫。吐溫可以洗滌掉非特異結合的抗體,多洗幾次。
*拍攝:封片后拍攝時,可以適當縮短激發(fā)光波長,使其沒有交叉波長。比較好的選擇:綠光488,紅光555。重合的波譜,就會不單純激發(fā)。拍出來就不單純。
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