當前位置:靶點科技(北京)有限公司>>技術文章>>細胞免疫熒光實驗 Protocol
一、實驗概述及試劑準備
細胞免疫熒光實驗通過特異性抗體與細胞內相應抗原結合,再利用熒光標記的二抗進行檢測,從而實現對細胞內蛋白的可視化。這一技術在細胞結構與
功能研究、疾病機制探索等方面具有重要應用。
1. 抗體選擇
一抗需特異性識別目標蛋白,熒光二抗則要與一抗來源動物種屬相匹配。例如,如果一抗是小鼠來源,二抗需是抗小鼠的熒光抗體。
2. 固定劑與破膜劑
4% 多聚甲醛用于固定細胞,保持細胞結構。曲拉通(破膜劑)用于通透細胞膜,使抗體能夠進入細胞內與抗原結合,但對于膜蛋白染色則可能不需要
此步驟。
3. 封閉試劑
BSA(牛血清白蛋白)或二抗來源動物的血清(如山羊血清)用于封閉非特異性結合位點,減少背景熒光。
4. 其他試劑
PBS 用于清洗細胞,DAPI 用于染細胞核,抗熒光淬滅封片劑用于封片并防止熒光淬滅,可選用含 DAPI 的封片劑簡化操作。
5.玻片選擇
-貼壁細胞:可使用蓋玻片或專用細胞爬片,還有共聚焦小皿可供選擇。不同規格的共聚焦培養皿(如圓形的 φ24mm、φ20mm、φ14mm、φ8mm)分別對應不
同孔板配套用細胞爬片。
-懸浮細胞:直接使用靶點科技懸浮細胞免疫熒光專用玻片(Biotarget)。不要再用傳統的方法,否則掉片不可避免。
二、細胞爬片準備及操作
1.爬片處理(非共聚焦小皿)
將剪裁好的爬片或購買的成品爬片,置于濃硫酸中浸泡過夜,然后用自來水沖洗干凈。接著將其置于消毒飯盒中,飯盒底面放紗布,玻片斜靠在飯盒側
壁且正面不接觸紗布,進行高壓蒸汽滅菌后烘干。
對于原代細胞或貼壁不牢的細胞,爬片前最好用多聚賴氨酸、層粘蛋白或膠原溶液處理玻片以增加細胞粘附性,處理后用培養基沖洗 1 - 3 遍再放入培
養基中。
2.共聚焦小皿
無需前處理操作,直接在超凈臺打開包裝,加入細胞懸液,蓋上皿蓋,置于培養箱中培養即可。
三、實驗操作
1.細胞接種準備
胰酶消化細胞后計數,重懸細胞于培養基中。根據玻片大小,在每個孔里放爬片的位置先滴 100ul 培養基,使玻片與培養皿靠培養基張力粘合,然后放
玻片,防止加細胞懸液時玻片漂起。
2.細胞接種
根據實驗需要及細胞生長情況選擇合適的細胞密度接入培養板內。待細胞貼壁后,可去上清加含藥培養基。
3.玻片取出
按照實驗設計,作用一定時間后取玻片(通常作用 24h)。取玻片時,可將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤,輕輕勾起爬片,用小鑷子取出。對于多時
間點實驗,取出所需數量的爬片時應用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子,未取出的可接著繼續培養。
四、固定、通透及封閉步驟
1.清洗與固定方式
可以將爬片取出用 PBS 清洗后固定,也可以直接在孔板中清洗并固定。共聚焦小皿則直接移除培養基,加入 PBS 清洗 1 - 3 次(不可劇烈搖晃),然后
加入 4% 多聚甲醛進行固定,通常在室溫(RT)固定 15 - 20min。
2.通透及封閉劑選擇與作用條件
如果抗體針對胞內蛋白,則需要通透步驟。常用的透化劑是 0.1% Triton X - 100(將 100% 的成品用 PBS 稀釋),作用 10min,但文獻中也有用 0.2% 或 0.5% Triton X - 100 的,具體可根據預實驗進行調整。
BSA 濃度為 1% 或 5%(用 PBS 溶解),血清濃度為 10%,在室溫(RT)封閉 30min。如果一抗結合力很強或二抗有非特異性結合,可添加 0.1% Tween20。
五、抗體孵育及染色封片
1.一抗稀釋與孵育條件
封閉結束后,用 PBS 清洗 3 遍,然后孵育一抗。一抗可用封閉液稀釋,也可以用 PBS 或抗體稀釋液,在 4℃孵育過夜。一抗稀釋比例可參照抗體說明書,建議從推薦比例中間開始試。
2.二抗孵育操作
次日吸走一抗(可回收)后,用 PBST 清洗 3 遍,每次 5 - 10min,然后避光孵育二抗 1h。
3.DAPI 染色操作
去除二抗,用 PBS 清洗三次,加入 DAPI,室溫靜置 5min,去除 DAPI,再用 PBS 洗 3 次。
4.封片操作
向載玻片上加入一滴封片劑,將蓋玻片緩慢扣在載玻片上,細胞所在面靠近載玻片,用吸水紙吸除多余封片劑。
免疫熒光,其實各種Protocol大同小異,核心除了多聯系,還要多思考。弄懂背后的邏輯。不能機械的做。
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