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蘇州千舍生物科技有限公司

細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及其解決辦法

時(shí)間:2022-2-16閱讀:2516
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細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及其解決辦法

1. 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基?

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)。總之,MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始。

2. 何時(shí)須更換培養(yǎng)基?

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定, 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間,按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基?

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基,若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基, 細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng), 造成細(xì)胞無(wú)法存活。

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類?

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清,在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼, 請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 % 或10% CO2?或根本沒有影響?

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng),而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 % CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí), 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。

7.Hank's 蛋白酶(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么?Hank's 蛋白酶(HBS)和Earle's蛋白酶(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別?

HBS和 EBS 的主要差別在于氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會(huì)變堿,Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織,用Hanks液就可以了。

8. 細(xì)胞之接種密度為何?

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。

9. 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理?

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中, 稀釋細(xì)胞濃度即可,若培養(yǎng)液太多時(shí), 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高, 直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶,加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度, 重復(fù)前述步驟即可。

10.冷凍管應(yīng)如何解凍?

取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化, 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí), 必須注意安全, 預(yù)防冷凍管之爆裂。

11. 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí), 是否應(yīng)馬上去除DMSO?

除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO 敏感之細(xì)胞外, 絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞), 在解凍之后, 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中,待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問題。

12. 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度?應(yīng)如何處理?

一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中,保存于–20 °C,避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低,并可減少污染之機(jī)會(huì)。

13.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái),其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?

欲回收動(dòng)物細(xì)胞, 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘, 過高之轉(zhuǎn)速, 將造成細(xì)胞死亡。

14. 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何?

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中, 必須使用前先行配制完成。

15.DMSO 之等級(jí)和無(wú)菌過濾之方式為何?

冷凍保存使用之DMSO 等級(jí), 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即為無(wú)菌狀況, 第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中, 保存于4°C,避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì), 并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。

16.冷凍保存細(xì)胞之方法?

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 °C 不可超過1 小時(shí),以防止冰晶過大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。

17. 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí), 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度?

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素?

除于特殊篩選系統(tǒng)中外, 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下, 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

19.應(yīng)如何避免細(xì)胞污染?

細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染好方法。

20.如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí),應(yīng)如何處理?

原則上:直接滅菌后丟棄之。

當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí),研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母,把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開,用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái),檢查HEPA過濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性,因而,做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如霉素b和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。

1.在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞,稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。

2.分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi),把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如,霉素b推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。

3.每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo),如脫落,出現(xiàn)空泡,匯合度下降和變圓。

4.確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2~3代。

5.在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。

6.重復(fù)步驟4。

7.在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4~6代,確定污染是否以已被消除。

21.支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞,是否能以肉眼觀察出異狀?

不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外,大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株,無(wú)法以其外觀分辨之。

22.支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響?

支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù), 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free,實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

23. 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí), 該如何處理?

直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細(xì)胞株。

24. CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔?

定期(至少每?jī)芍芤淮? 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。

25.為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中, 顏色會(huì)偏暗紅色, 且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性?

培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中, 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果,將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí),可以通入無(wú)菌過濾之CO2, 以調(diào)整pH 值。

26. 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish,flask是否均相同?

不同廠牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒有太大之影響,惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長(zhǎng)差異。

27. 購(gòu)買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形?

研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少, 大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤,造成細(xì)胞的物理性損傷, 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心, 應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

28.購(gòu)買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因?

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳, 常見原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后,加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80 °C 太久。

29. 收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因?

冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng),造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象,冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí),均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。

30.L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解,但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。

31.GlutaMAX-I是什么?培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I?這個(gè)二肽有多穩(wěn)定?

GlutaMAX-I 二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎*降解。

32.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?

酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑:中性時(shí)為紅色,酸性時(shí)為黃色,堿性時(shí)為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細(xì)胞,尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí),用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè),一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí),不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

33.如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞?

用無(wú)血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200~2000個(gè)/毫升,在0.1毫升細(xì)胞懸液中加0.1毫升0.4%的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻,數(shù)分鐘后,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭,因而染成藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞。

34.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么?

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源,盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

35.二價(jià)離子抑制蛋白酶活性嗎?使用蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么?

二價(jià)離子的確抑制蛋白酶活性。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制蛋白酶的活性。建議蛋白酶處理細(xì)胞前,用EDTA清洗細(xì)胞,以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。

36.室溫下配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用時(shí)PH值是多少?

緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃時(shí),不同PH值。 

37.如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞?能用蛋白酶消化嗎?

我們推薦使用脫落細(xì)胞的方法,此技術(shù)破壞性最小,生活力最高。通過使用巴斯德吸液管,讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動(dòng)。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對(duì)必要的情況下,才使用消化細(xì)胞。

38.消化一個(gè)T25瓶的sf9細(xì)胞:

1. 去除培養(yǎng)基。

2. 用2ml 1xPBS(足以覆蓋細(xì)胞表面)洗滌細(xì)胞,去除PBS。

3. 加入2ml 1xEDTA(恰好覆蓋細(xì)胞表面)。

4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測(cè)看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。

5. 向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液,移入錐形管,用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁,移入同一錐形管中。(培養(yǎng)基中的FBS終止了的活性。)

6. 離心(1100rpm)沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。

7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。

39.在Sf9, Sf21, 和high Five細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí),肝素的使用量是多少?

為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成,使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液。

40.在重新凍存sf9細(xì)胞前,它可以傳多少代?隨著傳代的次數(shù)的增加,它的感染能力會(huì)降低嗎?

通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過30次傳代后,應(yīng)該返回凍存。無(wú)論什么時(shí)候計(jì)數(shù)時(shí),都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過95%的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍,細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降,它們的感染力將不在是有效的。

41.貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基,在放置幾天后顏色變紫?

這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時(shí),碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口,在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘,來(lái)校正溶液的pH值(確定松開瓶口以保證氣體交換)。

42. 細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍,可否繼續(xù)使用?

如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍,您應(yīng)該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生,培養(yǎng)基可以正常使用,如果出現(xiàn)沉淀,只能丟棄這些培養(yǎng)基。

43. 無(wú)血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎?

當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí),降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下,抗生素不被滅活,可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。

44. 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后,可長(zhǎng)期保存嗎?

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí),您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。

45.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎?

大部分添加物和試劑最多可以凍融3次,如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會(huì)影響它的性能。


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