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免疫熒光單標(biāo)記和雙標(biāo)記的方法
1. 免疫熒光單標(biāo)記方法
免疫 熒光單標(biāo)記是指只標(biāo)記一種蛋白質(zhì)分子,方法比較簡單,只要按照染色步驟去做,通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇,固定液選擇的合適與否,可能會直接影響染色結(jié)果。具體染色方法如下。
1)所需材料與試劑
(1)培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達(dá)到60%一70%的細(xì)胞。
(2)一抗、FITC或TRITC標(biāo)記的二抗。
(3)4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃預(yù)冷20min)。
(4)封閉液。
(5)0.01mol/LPBS緩沖液。
2)染色方法
(1)取出培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片或glass―bottom培養(yǎng)皿,用0.01MPBS洗2―3遍
(2)加入0.3%的TritonX―100,37℃,30rain。
(3)加入4%多聚甲醛室溫固定30min或冷丙酮4℃固定10min。
(4)正常阻斷血清1:20封閉室溫20~30min,抑制IgG的非特異性結(jié)合。阻斷血清必須選擇與二抗同一種屬的正常血清。
(5)去掉正常血清,直接加入一抗,37C孵育1h或4℃過夜。抗體以0.01mol/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗(yàn)而定)。
(6)0.3%TritonX―100洗5min,0.01mol/IPBS洗5min,0.3%TritonX 5min,0.01MPBS洗5rain。
(7)加入FITC―二抗或TRITC―二抗,37℃,孵育1h。
(8)0.3%TritonX―100洗5rain,0.01mol/LPBS洗5min,0.3%TritonX 5min,0.01mol/LPBS洗5mln,用濾紙吸干。
(9)90%甘油(PBS配制)封片。
(10)激光掃描共焦顯微鏡下觀察,或于4℃避光保存。
2.免疫熒光雙標(biāo)記方法
免疫熒光的雙標(biāo)記是指同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子,當(dāng)懷疑某種配體與已知受體結(jié)合后可用此方法加以證明。此方法稍微復(fù)雜一些,首先應(yīng)注意所用的一抗必須是來自不同種屬動物的兩種特異性抗體(例如:A抗體為多克隆抗體,來自家兔;B抗體為單克隆抗體,來自小鼠)。其次,兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應(yīng)重疊,且盡量遠(yuǎn)離,通常可以選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5,或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下,染色時(shí)兩種一抗可以同時(shí)孵育,然后可以同時(shí)孵育兩種二抗。但當(dāng)染色結(jié)果一種顏色非常弱,而另一種顏色比較強(qiáng)時(shí),應(yīng)考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標(biāo)記。
3,樣品制備注意事項(xiàng)
(1)在進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記時(shí),如樣品的來源為組織,應(yīng)采用冷凍切片。
(2)樣品制備應(yīng)滿足一般熒光顯微鏡觀察的要求
(3)盡量去除非特異性熒光信號。細(xì)胞經(jīng)熒光染色后可能會產(chǎn)生自發(fā)熒光,可用PBS取代一抗作為對照,以區(qū)分自發(fā)熒光和陽性結(jié)果。
(4)為了不將細(xì)胞壓扁,蓋玻片與載玻片之間的介質(zhì)多用甘油與PBS混合液(9:1)封片,甘油還有抗熒光淬滅的作用。同時(shí)還應(yīng)注意封片時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。
(5)用指甲油將蓋玻片四周封片,注意避免將細(xì)胞壓扁。
(6)為防止熒光淬滅,可在介質(zhì)中加入抗氧化劑DABCO(100mg/mi),室溫,密封可保存6個(gè)月;或苯二胺(100mg/mi),-20℃,保存2~3周。
蘇州千舍熱賣熒光標(biāo)記細(xì)胞:
人肺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 A549+luc
人膽囊癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 GBC-SD+LUC
人永生化表皮細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HACAT+LUC
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HCC827+LUC
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人宮頸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HELA+LUC
人胃癌細(xì)胞黃色熒光標(biāo)記 HGC-27+YFP
人結(jié)直腸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 LOVO+LUC
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人乳腺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 MDA-MB-231+LUC
人高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 MHCC-97H+luc
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人乳腺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 ZR-75-1+luc
小鼠乳腺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 4T1+luc
小鼠黑色素瘤細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 B16-F10+LUC
小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 CT26+LUC
小鼠膠質(zhì)細(xì)胞瘤熒光素酶標(biāo)記 GL-261+luc
小鼠肝癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HEPA1-6+LUC
小鼠卵巢上皮癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 ID8+LUC
小鼠骨肉瘤成骨細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 K7M2WT(K7M2-WT)-LUC
小鼠肺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 LLC+LUC
小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 MC38+LUC
小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 neuro
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