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WinSera無外泌體血清的常見問題?
能不能用無血清培液養(yǎng),能不能用正常培液養(yǎng)到70%換無外泌體血清的培液?
有些paper確實會使用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞然后收上清分離外泌體,論壇中也有已經發(fā)表文章的朋友使用該方法,該方法是使用含有外泌體的血清培養(yǎng)細胞到一定密度,然后吸去培液,PBS洗數(shù)次之后換無血清培液進行培養(yǎng)即可。但是目前很多高檔次的paper基本都是使用含無外泌體血清的培液進行細胞培養(yǎng)的,無外泌體血清可以按照之前hzangs的推文介紹的方法制備。 如果你的無外泌體血清比較珍貴,也可以考慮先將細胞使用有外泌體血清培養(yǎng),細胞長到一個合適的密度如70%-80%左右時,吸去培液,37℃預熱的PBS清洗細胞3-5遍,換無外泌體血清的培液即可。
那種分離方法好?
使用何種方法進行外泌體的分離是一個比較復雜的問題。這個問題涉及到你計劃的下游實驗是什么。通常來說下游實驗涉及RNA的,對外泌體純度要求可能不高,但是如果下游研究設計蛋白,那么對外泌體的純度要求還是比較高的。在此列出常見分離方法的一些優(yōu)缺點供大家根據(jù)自己的實驗進行選擇。超速離心法:操作繁瑣,技術難度高,耗時長,分離外泌體純度較高,目前分離外泌體的金標準;聚合物沉淀法:操作簡便,技術難度低,耗時短,分離外泌體純度低,可能被reviewer質疑;膜親和法:操作簡便,適用于RNA實驗,耗時短,技術難度低,分離外泌體的純度尚可接受;凝膠排阻法:操作相對簡單,技術難度略高,分離外泌體純度高,但很難保證無菌;抗體親和沉淀法:操作簡單,純度尚可,但是抗體很貴并且抗體不可回收利用。
用哪個marker做WB好?常用的是CD63、CD81等等,
外泌體蛋白做WB用什么內參基因?
外泌體做WB的內參基因一直存在爭議。但是按照David Lyden曾發(fā)表于CNS的paper,actin和GAPDH 都可以的。
用多少培液收外泌體?
培液使用量取決于細胞系。有些細胞系外泌體釋放量高,幾毫升即可;有些釋放量低,需要上百毫升。一般來說一個普通的細胞系,用超離分離外泌體,第一次摸索條件,起始培液量最好50ml以上。
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