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蘇州千舍生物科技有限公司

體內(nèi)細胞培養(yǎng)及操作步驟

時間:2022-9-13閱讀:1684
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內(nèi)細胞培養(yǎng)及操作步驟

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1、瘤細胞懸液接種

(1)無菌選取生長良好(有光澤,淡紅色)瘤組織或?qū)?shù)生長期培養(yǎng)瘤細胞。


(2)在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨,經(jīng)80~100目篩網(wǎng)過濾成細胞懸液。


(3)培養(yǎng)細胞應用PBS洗兩遍。


(4)計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至107~108/ml。


(5)常規(guī)消毒后,于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后注入細胞懸液(0.1ml/部位,>106細胞)。初次接種成功率低,細胞數(shù)盡可能多一些。


(6)次日注意觀察動物一般情況。初次接種一般有一段較長的潛伏期,以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短,最后固定為一個相對穩(wěn)定的時間。

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2、腹水瘤的建立與腹水瘤的接種 將實體瘤細胞直接種于小鼠腹腔、腹壁或其他部位,引起腹水,腹水中含有瘤細胞,將這種腹水反復傳代,即可成為腹水瘤。初次傳代時,腹水常呈血性(含大量紅細胞),反復傳代后腹水逐漸變成乳白色。腹水瘤的接種過程如下。

(1)將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細胞離心和洗滌,進行細胞計數(shù)。


(2)消毒動物,左下腹穿刺接種106腹水瘤細胞。


(3)接種腹水瘤細胞后約7~12d,待小鼠腹部明顯膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部,用9號針頭抽取腹水,也可行腹部解剖后,用滴管吸取。每只小鼠可抽3~5ml。


(4)抽取的腹水經(jīng)3000rpm離心15min,收集上清,分裝凍存?zhèn)溆谩?/span>

四、培養(yǎng)細胞的凍存及復蘇

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原代分離細胞培養(yǎng)是指從供體內(nèi)取出組織后,經(jīng)機械以及消化分離成單個細胞或單一型細胞群,使之在體外模擬人體生理環(huán)境,在無菌、適當溫度和一定的營養(yǎng)條件下,生存、生長和繁殖。原代培養(yǎng)細胞常有不同的細胞成分,生長緩慢,但是更能代表所來源的組織細胞類型和表達組織的特異性特征。利用原代細胞培養(yǎng)做各種實驗,如藥物測試、細胞分化及病毒學方面的試驗效果很好。其操作步驟如下。

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1、凍存細胞:

(1)選對數(shù)增生期細胞(證明無支原體污染),在凍存前1d換液。


(2)按常規(guī)方法把培養(yǎng)細胞制備成懸液,計數(shù),使細胞密度達5×107/ml左右密度,離心,去上清。


(3)加入配制好的凍存液(培養(yǎng)液6.8ml,小牛血清2ml,DMSO 1ml,5.6%NaHCO3 0.1ml),按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養(yǎng)液中加入保護劑10%二甲基亞砜(DMSO) 或甘油,可使冰點降低,使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外。


(4)分裝于無菌凍存管中,每管加1.5m懸液。


(5)旋好凍存管并仔細檢查,一定要蓋緊,做好標記。


(6)凍存:在特殊的儀器或簡易的液氮容器中,按-1℃/min的速度,在30~40min時間內(nèi),下降到液氮表面,再停30min后,直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度,過快能影響細胞內(nèi)水分透出,太慢則促進冰晶形成。


操作時應戴防護眼鏡和手套,以免液氮凍傷。

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2、復蘇細胞:

(1)從罐中取出凍存管。


(2)迅速放入36℃~37℃水浴,不時搖動,使其急速融化,30~60s內(nèi)完成。


(3)凍存管用70%酒精擦拭消毒后,打開蓋子,用吸管將細胞懸液注入離心管中,再滴加10ml培養(yǎng)液。


(4)低速離心(500~1000r/min) 5min,去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。


(5)用培養(yǎng)液適當稀釋后,裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng),次日更換一次培養(yǎng)液后,繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進行培養(yǎng)。


凍存細胞數(shù)量要充分,密度應達到107/ml,在融后稀釋20倍時,仍能保持5×105/ml數(shù)量。



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