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HepG2細胞廣泛應用于遺傳毒理學試驗、外源性生物性異物的細胞毒性、乙型肝炎病毒感染機制、病毒培養等方面的研究。由于其與肝細胞具有相同的生物學活性,還被用于胰島素抵抗的研究。
細胞名稱:人肝癌細胞細胞簡稱:HepG2種屬來源:人組織來源:肝疾病特征:肝癌細胞形態:上皮細胞樣生長特性:貼壁生長培養體系:MEM+10%FBS+1%Glutamax+1%NEAA+100mM Sodium Pyruvate+1%P/S傳代比例:1:2-1:4,每2-3天換液一次傳代周期:72-96 h培養條件:氣相:95%空氣+5%CO2,溫度:37℃凍存條件:60%基礎培養基+30%FBS+10%DMSO,液氮儲存傳代:吸去培養液。用 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次,以去除血清(血清會抑制胰酶的活性)。加2-3毫升Trypsin-EDTA,放在37℃培養箱內約5分鐘,直到細胞全部脫落。加6-8毫升培養液,用移液器把細胞吹散。加適量的細胞到新的培養器皿中。(以1:4至1:6為宜,傳代期間培養液每周更換2次)注釋:該細胞表達3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶還原酶和肝甘油三酸脂脂肪酶。該細胞在有(英文名:gramoxone)的環境下過氧化氫酶mRNA表達增加,ApoA-I mRNA 表達減少。
HepG2細胞培養的*佳培養條件
HepG2細胞的復蘇條件
1.1 復蘇溫度的選擇
細胞復蘇:快速將所凍存細胞40℃水浴搖床60轉/ min慢搖至其溶解,溶解后馬上轉入 37 ℃水浴箱,手工慢搖恒溫 2~3min復蘇 ,復蘇后 800 轉/ min 離心 5min,吸去上清加入 10ml 含 15%胎牛血清 DMEM 培養基 ,混勻后加入細胞培養板 ,每孔 1 ml,5%CO2溫箱 37℃培養。與傳統 37 ℃水浴方法復蘇后細胞存活率為 68.4% 相比較,先40℃溶解后再37℃恒溫方法復蘇的細胞存活率為85.7%,優于傳統方法。
1.2 復蘇用培養基的選擇使用RPMI-1640和DMEM兩種培養基對HepG2細胞進行培養,結果發現,用DMEM培養基培養的細胞結果在接種密度為1×104/c㎡、血清含量為15%時,經6h培養后細胞開始貼壁,12h后大部分細胞貼壁,且增值速度最快,4d后可以按1:3的比例傳代。而用RPMI-1640培養基培養的細胞在接種密度為1×104/c㎡、血清含量為20%時,經6h培養后細胞貼壁不明顯,但12h后部分細胞貼壁,24h后亦大部分細胞貼壁,且增值速度相對較慢,5天后可以按1:3的比例進行傳代。以上結果說明,使用DMEM培養基既可以節省血清,細胞貼壁所用時間短、增殖速度快,并且傳代細胞培養也使用DMEM培養基,使用DMEM培養基進行復蘇,避免了配制不同培養基所帶來的麻煩,因此在HepG2細胞復蘇中推薦使用DMEM培養基。
1.3 復蘇時的接種密度研究發現當接種密度為1×104/cm2,血清含量為20%時, 細胞24h后大部分貼壁, 且增殖速度最快, 5d后可按1:3比例傳代;當接種密度大于1×104/c㎡和(或)血清含量少于20%時, 細胞表現為貼壁困難, 出現進行性退化; 當接種密度小于1×104/c㎡ 血清含量為20%時, 細胞24h后大部分貼壁, 但增殖速度明顯減慢, 約7d后才可按1:3比例傳代。
消化酶及消化時間的選擇
如果用EDTA+胰酶的消化能力太強,消化時間不好把握,傳代消化后細胞死亡較多;單用EDTA消化能力太弱,消化時間太長且不易將細胞消化*;用PBS將細胞洗3次,再加入 0.25%胰酶,覆蓋細胞約30s后吸去胰酶,37℃放置 2~3 min,顯微鏡下可觀察到細胞消化適度。將待傳代細胞不用PBS洗滌和用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后分別用0.25%的胰蛋白酶溶液、0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進行消化(消化液用量為蓋滿瓶底),觀察時間為30秒、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分鐘。
結果發現:不用PBS洗滌的細胞分別用上述兩種酶消化,10分鐘后細胞仍然消化不*。用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后的細胞,再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化時,分別經3分鐘、1分鐘和0.5分鐘能*消化好細胞。而用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進行消化時,*消化好細胞約需3分鐘、1.5分鐘、1分鐘。二者的結果相符。
根據上述結果可知,在進行HepG2細胞的消化時,先用pH7.2的PBS洗滌三遍后,再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化0.5分鐘效果比較好。
另一種推薦使用的消化方法如下:用1×PBS將細胞洗滌2次 再加入適量的0.15%胰蛋白酶(含有0.02%EDTA并以7:3的體積比混合)覆蓋細胞約20秒后吸去胰蛋白酶 (含有0.02%EDTA并以7:3的體積比混合)。
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