0500胎牛血清
貨號:0500
規格:500ml
千舍生物開工大吉,干細胞專用,特級胎牛血清*......
細胞培養最基本的是做好污染防控,包括微生物污染的防控和細胞系間交叉污染的防控。
實驗中需保持良好的操作習慣,所用材料的位置擺放要順手,污染源和已滅菌物品要分開放置。實驗室也需定期清潔與消毒。
※血清與培養基
通常血清的添加比例為10%,當然也可根據細胞狀態和生長速率適當增加或減少添加比例。在更換血清品牌或者批次時,最好需對血清的品質進行驗證,防止對實驗造成影響。
對于培養基,目前商品化的比較成熟,穩定性也較好。如若需自配培養基時,過濾前攪拌時間不宜過長(培養基中營養豐富,細菌常溫下20min就可繁殖一代,其代謝產物會對培養基的品質產生影響)。培養基過濾除菌后,應對培養基進行無菌驗證,防止污染。
※細胞培養瓶
目前商品化的細胞培養瓶主要為瓶蓋是否帶氣孔兩種。其中不帶透氣孔細胞培養瓶擰緊后需適當回旋瓶蓋,保證CO2能順利進入細胞培養瓶。
細胞培養過程中,對于適應能力強的腫瘤細胞,可在傳代3-4次后更換新的細胞培養瓶。對于非腫瘤細胞系如293T,HEK293等細胞,建議每次傳代更換新的細胞培養瓶來保證細胞狀態。
※細胞傳代
正常細胞形態較好,輪廓清晰,邊緣透亮,細胞增殖狀況良好。當貼壁細胞長到密度90%時,需進行傳代。
傳代時通常使用胰酶消化法。該方法又分為干消化法和濕消化法。
干消化法:胰酶浸潤后棄去胰酶,待細胞變圓后加入新鮮培養基吹下后再進行細胞傳代。
濕消化法:待細胞變圓,肉眼觀察下成流沙狀脫落時即可加入新鮮培養基終止消化,1000rpm離心5min,棄去上清,用新鮮培養基重懸傳代。
吹打細胞時,手法要輕柔,避免吹打出氣泡,造成細胞因內外壓差破裂,同時需避免刮到瓶壁影響細胞的貼壁。
不同細胞的貼壁能力不同,消化時間不同;不同細胞細胞間連接強度不一樣,消化時間不同;同一細胞生長狀狀況不同,消化時間不同。消化時適時觀察細胞形態,避免因過度消化影響細胞活性。
傳代間隔時間和傳代比例因細胞而異。細胞傳代過程中,當細胞出現狀態不好或者污染時及時棄去細胞,重新復蘇。
※細胞凍存與復蘇
當細胞生長狀況較好或者代數較早時,需及時大量的凍存。
細胞凍存液比例為培養基:血清:DMSO=7:2:1,也可血清:DMSO=9:1。細胞凍存密度通常為1-3×106個/ml。細胞凍存采用慢凍方式,減少冰晶形成,避免細胞損傷。通常4℃放置0.5 h,-20℃放置2 h,-80℃冰箱中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內。
細胞復蘇時升溫要快,防止在解凍過程中水分進入細胞,形成冰晶,影響細胞存活。38℃水浴不時搖動,在1分鐘內使其*融化,1000rpm離心5min,棄去上清,用新鮮培養基重懸移入培養瓶中。
※用真誠感動細胞
俗話說,心誠則靈。對待細胞培養也應如此,“自己要用的細胞自己養",多去觀察細胞生長狀態。
所謂“知彼知己,百戰不殆"。培養細胞需要我們的耐心以及不斷的摸索和積累,了解了每種細胞各自的習性后,再“傲嬌"的細胞也能在我們的“真誠"下認真“成長"※※※※
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貼壁細胞傳代:
1)移棄使用過的細胞培養液。(不要直接倒掉,避免瓶口殘留導致易污染)
2)使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液(PBS)沖洗細胞。從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液,以避免攪動細胞層,前后搖晃容器數次,最后移棄沖洗液。(洗去殘留的血清,避免影響胰酶的活性。)
3)以 25 cm2的培養瓶為例,向瓶內加入1ml胰蛋白酶-EDTA(請根據各細胞的指引使用合適的濃度)消化液,輕輕搖動培養瓶,使消化液流遍所有細胞表面,放到37 ℃ 孵育。通常,幾分鐘內,會發現胞質回縮、細胞間隙增大,傾斜培養瓶時細胞層能自然流下,此時應加入2-3ml含血清的*培養液終止消化(細胞解離所需時間請參考各細胞的指引,并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細胞的解離情況)。另外,并不是所有貼壁細胞都適用采用胰蛋白酶進行解離,請根據各細胞的指引選擇合適的解離方法。
4)使培養瓶傾斜,吸取培養瓶內液體輕輕沖向原細胞生長表面,重復該動作2-3次,使所有細胞沿瓶底流下,再輕柔地把細胞吹打成單個懸液(吹打過程中應避免氣泡的產生)。
PS:對于難消化的細胞,盡量不要通過用力吹打的方式來處理,以免對細胞產生物理損傷。可以先將已經消化的細胞分出來,及時終止消化。然后再對仍然貼壁的細胞進行再次消化。做到分層消化,避免易消化細胞長時間在胰酶消化下受損。
5)把所有的細胞懸液轉移到15ml離心管中,800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。
6)加入新的含血清*培養液重懸成單細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例,把細胞懸液均勻分到各培養器皿中,補足新的含血清*培養液,輕輕搖晃混勻。
7)放到37 ℃ 孵育,第二天顯微鏡下觀察細胞的貼壁情況。
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