谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(微板法)

產品貨號：BA1823

產品規格：100T

產品簡介：

谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)是一種含硒的水溶性四聚體蛋白酶。幾平在所有組織中都有分布，在一些病理狀況下谷胱甘肽過氧化物酶的活力會發生明顯的變化，該酶可以清除活細胞內過氧化物，在保護細胞免受自由基損傷過程中起著關鍵作用。細胞內的脂類容易和自由基發生反應，產生脂類過氧化物。谷胱甘肽過氧化物酶不僅具有消除自由基和衍生物的作用，還與過氧化氫酶(CAT)、磷脂氫過氧化物谷胱甘肽過氧化物酶(PH-GSH-Px)、谷胱甘肽S轉移酶(GST)構成不同基質特異性的多水平的還原有機氫過氧化物系統，減少脂質過氧化物的形成，增強機體抗氧化損傷能力。

谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒(Glutathione Peroxidase AssayKit)是一種以過氧化氫為底物，通過微板法檢測細胞、組織或其它樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活性的試劑盒。絕大部分細胞內的谷胱甘肽過氧化物酶都是含硒的，且硒為該酶的活性中性組成部分。細胞內也有棲少量的不含硒的谷胱甘肽過氧化物酶存在。本試劑盒檢測的是最常見的含硒的谷胱甘肽過氧化物酶，該檢測法的缺點谷胱甘肽過氧化物酶可以利用還原型谷胱甘肽(GSH)催化過氧化氫以及許多有機過氧化物，產生水或有機醇，在特殊情況下會影響檢測準確性。硒是GSH-Px的必須組成部分，每分子該酶含有含有四分子硒，該酶的活性中心是硒半胱氨酸，測定該酶的活力可以衡量有機體硒水平。其檢測原理是：GSH-Px可催化谷胱甘肽(GSH)與苯甲酸顯色液發生氧化反應，使之生成黃色陰離子，通過酶標儀檢測422nm處吸光度值測定該陰離子的濃度，間接推算GSH減少的量。本試劑盒僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

產品組成：

自備材料：

1. 生理鹽水或PBS

2. 離心管、1.5mlEP管或96孔板

3. 酶標儀

4. 水浴鍋或恒溫箱

5. 離心機 

 操作步驟(僅供參考):

1. 樣本處理:

a.血清、血漿樣本：從待測樣本中分離出的血清或血漿不應有溶血，如果含有，應去除紅細胞后檢測，如超過檢測范圍，用生理鹽水稀釋后檢測。血清去除紅細胞的簡易方法如下:

用抗凝管收集血液，顛倒混勻。取至少500ul全血，4℃ 3000g離心5min。棄上清，用預冷的10倍體積的樣品勻漿液重懸紅細胞沉淀，再同前離心，棄上清。加入約4倍體積預冷的ddH2O裂解紅細胞沉淀， 12000 r/min 離心5min，取上清；亦可采用ACK紅細胞裂解液等去除紅細胞，取上清。

b.組織樣本：動物用含有20U/ml heparin的生理鹽水(0.9%NaCl containing20U/ml heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照每20mg組織加入200ul樣品勻漿液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿。4℃，12000g離心10min。取上清用于酶活性的測定。

c.細胞樣本：對于貼壁細胞，由于后續用于酶活性的測定，避免使用胰酶消化細胞。可以使用細胞刮或EDTA處理細胞收集細胞。細胞用PBS或生理鹽水洗滌1次。按照每10⁶細胞加入300-500ul勻漿液的比例用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿，4℃12000g離心10min，取上清用于酶活性的測定。亦可采用Western及IP細胞裂解液參考相應說明裂解細胞樣品，按照每10⁶細胞加入100-200u1裂解液的比例進行裂解，取上清用于酶活性的測定。

d.植物樣本：稱取0.2g新鮮樣品或-80℃凍存的樣品，放入預冷的研缽中，加入2ml 預冷的磷酸緩沖液(0.05M，pH7.0），在冰浴上研磨或勻漿，轉入離心管，4℃ 12000r/min 離心10~15min，取上清，用于酶活性的測定。

2. GSH工作液的配制：取0.5ml ddH20加入15.4mgGSH中，充分溶解開混勻，即獲得GSH儲存液(100mmol/L)，立即分裝后-20℃保存。取適量的GSH儲存液(100mmol/L)，按GSH配制液：GSH儲存液(100mmol/L)=99:1的比例稀釋至1mmol/L，即為GSH工作液(1mmol/L)，該溶液配制好以后可4℃保存1天。

3. 氧化工作液的配制：準確取氧化劑0.1ml加入6.5ml ddH20，即為氧化儲存液(100×)，4℃保存。臨用前，準確取氧化儲存液(100×)0.1ml加入6.5ml ddH2O，即為氧化儲存液 (100×)，4℃保存，臨用前準確取氧化儲存液(100×)0.1ml 加入 9.9ml ddH2O，即為氧化工作液；4℃保存，1天有效。

4. GSH-Px酶促反應：可參考下表設置檢測反應體系，依次加入試劑：

5. GSH-Px顯色反應：可參考下表設置檢測反應體系，依次加入試劑：

6. GSH-Px測定：混勻，置于室溫孵育1min，以ddH2O調零，用酶標儀檢測422nm處吸光度(即為A空白、A本底、A測定）；如果用酶標儀96孔板每孔應加250μl；如果用分光光度計，比色杯光徑應為1cm，加入的量應根據比色杯的最小量程而定；經測定，一般情況下A空白在0.003~0.05之間，A本底在0.1~0.3左右。

計算:

谷胱甘肽過氧化物酶酶活力單位的定義：排除非酶促反應，在37℃，每1L血清，1min內可以催化1μmol GSH 氧化所需(減少)的酶量為一個GSH-Px活性單位。

GSH-Px(U/L)=(A本底-A測定)/(A本底-A空白)×200

式中：A空白=空白對照的吸光度

A本底=本底對照的吸光度

A測定=待測樣品的吸光度

200=1000(ml)/5(min)

注：a、[檢測體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力的單位為U/L=mU/ml。

b、樣品(如組織樣本)中谷胱甘肽過氧化物酶活力=[檢測體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力]×稀釋倍數/樣品中的蛋白濃度]

[樣品中(如組織樣本)谷胱甘肽過氧化物酶活力]的單位為:U/mg或mU/mg蛋白樣品中的蛋白濃度1的單位為:mg/ml。

c、計算示例：樣品的蛋白濃度經測定為05mg/ml，稀釋2倍后進行測定。一般情況下，A空白在0.003~0.05之間，A本底在0.10~0.3左右。如果A本底＝0.30，A測定＝0.20，A空白＝0.003 那么:

液體樣本 GSP-Px活力=(0.30-0.2)/(0.30-0.003)×200×2=134.7U/L

組織樣本 GSP-Px活力=134.7U/L×2/(0.5mg/ml)=538.8mU/mg(蛋白)

參考區間：成年人血清GSP-Px：115~140 U /L

注意事項：

1. 上述低溫試劑避免反復凍融，以免失效或效率下降。

2. 本法中所有氧化劑或還原劑都會干擾本試劑盒的測定，如果在樣品中的還原劑無法避免，例如DTT、巰基乙醇等，則這些還原劑的總濃度至少低于0.1mM；0.15mM的DTT可以抑制 40%的酶活力。

3. 常用的 Triton X-100、Tween 20等去垢劑都含有較高水平的過氧化物，會影響本試劑盒的測定，如果必須使用這些去垢劑，最好使用純度較高并注明含較低濃度過氧化物的去垢劑。

4. 樣品取出后最好立即測定，也可以-80℃凍存待以后測定。

5. 一定要嚴格控制反應時的溫度，否則會引起較多誤差。

有效期：12個月有效。