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α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性檢測試劑盒(微量法)說明書

時間:2023/6/2閱讀:248
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α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性檢測試劑盒(微量法)

產品貨號:BA1937

 

產品規格:100/48

 

產品簡介:

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Arabinofuranosidaseα-L-Af)屬于糖基水解酶家族,可以從含有阿拉伯糖殘基的多聚物如阿拉伯木聚糖、阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖等的非還原末端水解生成一個L-阿拉伯糖分子。該酶在半纖維素降解以及果實的成熟軟化過程中有著重要作用。

α-L-Af分解對硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷生成對-硝基苯酚,對-硝基苯酚在400nm處有最大吸收峰,通過測定400nm處吸光值變化可計算得α-L-Af活性。

注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

 

產品組成:

試劑名稱

規格

保存條件

提取液

液體100mL×1

2-8

試劑一

粉劑×2

-20

試劑二

液體35mL×1

2-8

標準品

液體1mL×1

2-8

溶液的配制:

1. 試劑一:臨用前取1加入1.37mL蒸餾水,充分溶解,用不完的試劑建議分裝后-20℃保存一周,避免反復凍融。

2. 標準品:5µmol/mL的對-硝基苯酚。

 

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、臺式低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器冰和蒸餾水、EP管。

 

操作步驟:

一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)

1. 組織:按照組織質量(g:提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取0.1g組織,加入1mL提取液),冰浴勻漿。15000g4℃離心10min,取上清(若為綠色植物的莖、葉、芽等組織,建議將上清用提取液稀釋5倍后檢測;若為果肉等組織,上清可直接檢測或根據預測定結果稀釋相應倍數后檢測)置冰上待測。

2. 細菌、細胞:先收集細胞或細菌樣本到離心管內,離心棄上清后,按照細胞數量104個:提取液體積(mL500~1000:1的比例,建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞或細菌(功率200w,超聲3s,間隔7s,總時間3min),然后15000g4℃,離心10min,取上清,置冰上待測。

3. 液體:直接測定。

二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min以上,調節波長至400nm,蒸餾水調零。

2. 5µmol/mL的對-硝基苯酚標準液用提取液稀釋為50025012562.531.2515.625nmol/mL的標準溶液備用。

3. 操作表 (1.5mL離心管中)

試劑名稱μL

對照管

測定管

標準管

空白管

試劑一

-

40

-

-

蒸餾水

40

-

40

100

樣本

60

60

-

-

標準溶液

-

-

60

-

混勻,37℃水浴或恒溫培養箱中準確反應30min

試劑二

200

200

200

200

混勻,吸取200µL于微量玻璃比色皿或96孔板中,測定400nm處吸光值A,分別記為A 對照管、A測定管、A標準管、A空白管。計算ΔA=A測定管-A對照管,ΔA標準=A標準管-A空白管。每個測定管需設一個對照管,標準曲線只需檢測1-2次。

三、α-L-Af活性計算

1. 標準曲線的繪制:

以各個標準溶液的濃度為x軸,其對應的ΔA標準為y軸,繪制標準曲線,得到標準方程ykx+b,將ΔA帶入方程得到xnmol/mL)。

2. α-L-Af 活性的計算:

(1)按蛋白濃度計算

酶活定義:每mg蛋白每小時產生1nmol-硝基苯酚為1個酶活力單位。

α-L-Af 酶活(U/mg prot= x×V提取÷V提取×Cpr÷T=2x÷Cpr

(2)按樣本質量計算

酶活定義:每g樣本每小時產生1nmol-硝基苯酚為1個酶活力單位。

α-L-Af 酶活(U/g質量)= x×V提取÷W÷T= 2x÷W

(3)按照細胞或細菌數量計算

酶活定義:每104個細胞每小時產生1nmol-硝基苯酚為1個酶活力單位。

α-L-Af 酶活(U/104 cell= x×V提取÷細胞數量(萬個)÷T= 2x÷細胞數量(萬個)

(4)按液體體積計算

酶活定義:每mL樣本每小時產生1nmol-硝基苯酚為1個酶活力單位。

α-L-Af 酶活(U/mL=x×V÷V÷T=2x

V提取:提取液體積,1mLV樣:加入的樣本體積,0.06mLCpr:樣本蛋白濃度,mg/mL,蛋白濃度自行測定;W:樣本質量,gT:反應時間,0.5h

 

注意事項:

1. AΔA大于1.2時,建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定

2. 正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定,若濃度過高,建議將樣本用提取液稀釋適當倍數后再進行測定,并在計算公式中乘以稀釋倍數;若濃度過低,建議在樣本提取時增加組織質量。

3. 加入試劑二后,建議5min內讀取OD值。

 

 

 

 


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