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400-611-0007

α-葡萄糖苷酶(α-GC)活性檢測試劑盒(可見分光光度法)使用說明

時間:2023/8/18閱讀:199
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α-葡萄糖苷酶(α-GC)活性檢測試劑盒(可見分光光度法)

產品貨號:BA1933

 

產品規格:50T/24S

 

產品簡介:

α-GC(EC 3.2.1.20)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,催化水解芳基或烴基與糖基之間的α-糖苷鍵 生成葡萄糖,不僅與細胞壁的松弛或加固有關,而且與細胞識別和一些信號分子產生密切相關。

α-GC分解對-硝基苯-α-D吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通過測定吸光值升高速 率來計算α-GC活性。

 

注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

 

產品組成:

試劑名稱

規格

保存條件

提取液

液體50mL×1

2-8

試劑一

粉劑×2

-20

試劑二

液體25mL×1

2-8

試劑三

液體80mL×1

2-8

標準品

液體1mL×1

2-8

溶液的配制:

1. 試劑一:臨用前取110mL蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑-20℃保存4周,避免反復凍融。

2. 標準品:5μmol/mL的對硝基苯酚溶液。

 

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、超聲破碎儀、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

 

操作步驟:

一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)

1. 細菌或培養細胞的處理:收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照每1000萬細菌或細胞加入1mL提取液,超聲波破碎細菌或細胞(功率200W,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),15000g4℃,離心20min,取上清,置冰上待測。

2. 組織的處理:稱取約0.2g組織,加入1mL提取液進行冰浴勻漿;15000g4℃,離心20min,取上清,置冰上待測。 液體樣本:直接檢測。若溶液有渾濁需離心后取上清進行測定。  

二、測定步驟

1. 分光光度計預熱30min以上,調節波長至540nm,蒸餾水調零。

2. 標準溶液的稀釋:將 5μmol/mL的標準液用蒸餾水稀釋成100502512.56.250nmol/mL標準溶液待測。

3. 標準液稀釋可參考下表。

 

序號

稀釋前濃度(nmol/mL

標準液體積(µL

蒸餾水體積(µL

稀釋后濃nmol/mL

1

5000

100

400

1000

2

1000

200

1800

100

3

100

1000

1000

50

4

50

1000

1000

25

5

25

1000

1000

12.5

6

12.5

1000

1000

6.25

7

6.25

0

1000

0(空白管)

實驗中每個標準管需500µL標準溶液。

4. 加樣表

試劑名稱μL

測定管

對照管

標準管

試劑一

400

-

-

試劑二

500

500

-

樣本

100

100

-

充分混勻,放入37℃水浴鍋/恒溫培養箱中準確反應30min后,立即放入沸水浴中煮沸5min(蓋緊,以防止水分散失),流水冷卻后充分混勻(以保證濃度不變)

試劑一

-

400

-

充分混勻,8000g4℃,離心5min,取上清液待測

上清液

500

500

-

標準液

-

-

500

試劑三

1000

1000

1000

充分混勻,室溫靜置2min后,于400nm處測定吸光值A,分別記為A測定管、A對照管、A標準管、 A空白管。計算ΔA測定=A測定管-A對照管。ΔA標準=A標準管-A空白管。每個測定管需設一個對照管。 標準曲線和空白管只需測1-2次。

三、α-GC活力計算

1. 標準曲線的建立:

根據標準管的濃度(xnmol/mL)和吸光度(yΔA標準),建立標準曲線。根據標準曲線,將ΔAyΔA測定)代入公式計算樣本產物濃度xnmol/mL)。

2. α-GC活力計算

(1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白在每mL體系中每小時產生1nmol-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

α-GC活力(U/mg prot=x×V反總)÷V×Cpr÷T=20x÷Cpr

(2)按樣本質量計算:

單位的定義:每g組織在每mL體系中每小時產生1nmol-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

α-GC活力(U/g 質量)=x×V反總)÷W×V÷V樣總)÷T=20x÷W

(3)按細菌或細胞數量計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞在每mL體系中每小時產生1nmol-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

α- GC活力(U/104 cell=x×V反總)÷1000×V÷V樣總)÷T=0.02x

Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL,蛋白濃度需要另外測定;V反總:反應體系總體積,1mLV樣:加入反應體系中樣本體積,0.1mLV樣總:加入提取液體積,1mLW:樣本質量,g1000:細胞或細菌總數,1000萬; T:反應時間,0.5h

 

注意事項:提取液中含有使蛋白變性的成分,故按蛋白濃度計算時需要重新提取蛋白進行測定。


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