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β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)活性檢測試劑盒(微量法)使用說明書

時間:2023/8/18閱讀:296
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β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)活性檢測試劑盒(微量法)

產品貨號:BA1932

 

產品規格:100T/48S

 

產品簡介:

β-1,3-GA( EC 3.2.1.73)主要存在植物中,催化 β-1,3-葡萄糖苷鍵水解。在植物染病或處于其他逆境條件下,可 誘導細胞大量合成β-1,3-GA,因此β-1,3-GA活性測定廣泛應用于植物病理和逆境生理研究。

β-1,3-GA水解昆布多糖,內切β-1,3-葡萄糖苷鍵,產生還原末端,通過測定還原糖生成速率,來計算其酶活性。

 

注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

 

產品組成:

試劑名稱

規格

保存條件

提取液

液體100mL×1

2-8

試劑一

粉劑×2

2-8

試劑二

液體30mL×1

2-8

標準品

粉劑×1

2-8

溶液的配制:

1. 試劑一:臨用前取1支加1mL蒸餾水溶解,用不完的試劑2-8℃保存4周;

2. 標準品:10mg無水葡萄糖。臨用前加入1mL蒸餾水溶解,配制成10mg/mL葡萄糖溶液備用,2-8℃保存2周。

 

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

 

操作步驟:

一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)

1. 組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液), 進行冰浴勻漿。12000g4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2. 細菌或細胞:收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照每500萬細菌或細胞加入1mL提取液,超聲波破碎細菌或細胞(功率200w超聲3s,間隔10s,重復30次);12000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。  

二、測定步驟

1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至540nm,分光光度計蒸餾水調零。

2. 標準品的準備:將標準品用蒸餾水稀釋至10.80.60.40.2mg/mL

3. 標準品稀釋表。

序號

稀釋前濃度(mg/mL

標準液體積(µL

蒸餾水體積(µL

稀釋后濃(mg/mL

1

10

100

900

1

2

1

160

40

0.8

3

1

120

80

0.6

4

1

80

120

0.4

5

1

40

160

0.2

實驗中每個標準管需35µL標準溶液。

4. 樣本測定(在1.5mL EP管中依次加入下列試劑):

試劑名稱μL

測定管

對照管

標準管

空白管

樣本

35

35

-

-

標準液

-

-

35

-

蒸餾水

-

35

35

70

試劑一

35

-

-

-

充分混勻,放入37℃水浴60min

試劑二

230

230

230

230

充分混勻,沸水浴5min(蓋緊,防止水分散失),流水冷卻,取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板中,540nm 處記錄各管吸光值AΔA=A測定-A對照。空白管和標準曲線只需做1-2次。

如果吸光值大于2,可以用提取液對樣本稀釋后測定。

三、β-1,3-GA活性計算

1. 標準曲線的建立:

根據標準管吸光度 xA標準管-A空白管)和濃度(ymg/mL)建立標準曲線,將ΔA帶入公式中計算出樣本中產生的還原糖的含量y值(mg/mL)。

2. β-1,3-GA活性計算:

1按蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每小時產生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。

β-1,3-GA (U/mg prot)=(y×V1)÷(V1×Cpr)÷T=y÷Cpr

(2)按樣本質量計算 單位的定義:

g組織每小時產生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。

β-1,3-GA (U/g 質量)=(y×V1)÷(W×V1÷V2)÷T=y÷W

(3)按細菌或細胞數量計算

單位的定義:每1萬個細胞或細菌每小時產生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。

β-1,3-GA (U/104 cell)=( y×V1)÷(500×V1÷V2)÷T=0.002×y

V1:加入反應體系中樣本體積,0.035mLV2:加入提取液體積,1mLCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW: 樣本質量,gT:反應時間,60min=1h500:細菌或細胞總數,萬。

 

 

 

 


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