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上海尚寶生物科技有限公司
初級會(huì)員 | 第4年

400-611-0007

AnnexinV Alexa Fluor488/PI 凋亡檢測試劑盒使用說明書

時(shí)間:2023/11/20閱讀:100
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AnnexinV Alexa Fluor488/PI 凋亡檢測試劑盒

產(chǎn)品貨號: BA1985

產(chǎn)品規(guī)格: 20T/50T/100T

產(chǎn)品簡介

細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面,這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外,使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂,正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面,在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性,對PS有高度的親和性。因此,該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的PSPS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡的,也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的,而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此,可以采用Annexin VPI雙染的方法,通過流式檢測細(xì)胞早期凋亡。

圖片1.png

Jurkat 細(xì)胞用紫外誘導(dǎo)凋亡后用 Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 雙染流式分析圖譜

產(chǎn)品組成:

產(chǎn)品名稱

20T

50T

100T

保存條件

10× (Binding Buffer 10×)

2ml

5ml

10ml

2-8

Propidium Iodide

0.1ml

0.25ml

0.5ml

2-8

rhAnnexin V/Alexa Fluor 488

0.1ml

0.25ml

0.5ml

2-8

操作步驟(僅供參考):

1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備:

a) 對于貼壁細(xì)胞:小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞,至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時(shí),加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液,吹打下所有的貼壁細(xì)胞,并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000rpm左右離心5min,沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞,如果細(xì)胞無法離心至離心管底可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約50µl左右的培養(yǎng)液,以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS,重懸細(xì)胞,再次離心沉淀細(xì)胞,小心吸除上清;

b) 對于懸浮細(xì)胞:1000rpm左右離心5min,沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞,如果細(xì)胞無法離心管底,可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約50µl左右的培養(yǎng)液,以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS,重懸細(xì)胞,再次離心沉淀細(xì)胞,小心吸除上清;

2. 用去離子水按1:9稀釋結(jié)合緩沖液(2ml 10×結(jié)合緩沖液+18ml去離子水)

3. 1×結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞,調(diào)節(jié)其濃度為1-5×106 /ml

4. 100µl的細(xì)胞懸液于5ml流式管中,加入5µl Annexin V/Alexa Fluor 488混勻后于室溫避光孵育5分鐘;

5. 加入5µl 20ug/ml的碘化丙錠溶液(PI),并加400µl PBS,立刻進(jìn)行流式檢測。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):

空白管:陰性對照組細(xì)胞,不加Annexin V/Alexa Fluor 488,碘化丙錠溶液(PI)用于調(diào)節(jié)電壓。

單染管:陽性對照組細(xì)胞,只加Annexin V/Alexa Fluor 488用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

檢測管:處理的細(xì)胞,加加Annexin V/Alexa Fluor 488,碘化丙錠溶液(PI)。用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后,獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

注意事項(xiàng):

1. Annexin V是與磷脂酰絲氨酸(PS)親和,而PS在不同種屬間沒差異。在正常細(xì)胞中,PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè),而在細(xì)胞凋亡早期,PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。

2. 低濃度胰酶消化,輕柔吹打貼壁細(xì)胞23次,離心機(jī)41000rpm 5min離心,處理得當(dāng)?shù)脑挘让冈斐蓳p傷可以控制在5%以內(nèi),有對照組的情況下對實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會(huì)造成明顯影響。

3. 先加PI不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷,而且PI本身對細(xì)胞也是有毒性的,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響會(huì)比胰酶大,不建議這樣做。

4. Annexin VCa依賴的蛋白,所以不能加入EDTA,防止EDTA螯合了Ca離子從而影響Annexin V,進(jìn)而影響結(jié)果。

5. 用流式檢測凋亡時(shí),PI受時(shí)間的影響很大,因標(biāo)記了PI后會(huì)加大細(xì)胞毒性,隨著時(shí)間延長會(huì)導(dǎo)致PI的染色增加,特別是檢測早期凋亡時(shí),如果時(shí)間延長除了會(huì)導(dǎo)致在流式細(xì)胞儀上的細(xì)胞分群差距加大外誤差會(huì)明顯加大。一般PI加上后立刻上機(jī),然后在一個(gè)小時(shí)內(nèi)檢測完成。兩種方法都可以,但是按照我們操作步驟造成的誤差會(huì)更小。

保存條件:2-8℃避光,勿冷凍。6個(gè)月有效。




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