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γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL)活性檢測試劑盒
(可見分光光度法)
產(chǎn)品貨號:BA1031
產(chǎn)品規(guī)格:50管/24樣
產(chǎn)品內容:
試劑一:液體40mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存。臨用前加14mL蒸餾水充分震蕩溶解,用不完的試劑-20℃分裝保存,禁止反復凍融。
試劑三:粉劑×1支,4℃保存。臨用前加3.5mL蒸餾水充分震蕩溶解。
試劑四:液體16mL×1瓶,4℃保存。
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入30mL蒸餾水,充分震蕩溶解后,緩緩加入1.0mL濃硫酸(自備),邊加邊攪拌。
標準品:液體1mL×1支,4℃保存。1μmol/mL磷標準溶液。
產(chǎn)品說明:
GCL(glutamate cysteine ligase)是GSH合成的限速酶,GSH對GCL有反饋抑制作用。GCL基因表達受多種因素調節(jié),如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。
在ATP和Mg2+存在下,GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸;同時ATP去磷酸化產(chǎn)生無機磷分子,通過測定無機磷增加速率,即可計算出GCL活性。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、冷凍離心機、水浴鍋、移液器、1mL玻璃比色皿、濃硫酸和蒸餾水。
操作步驟:
一、粗酶液提取:
1. 組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2. 細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體:直接測定。
二、GCL測定操作:
1. 分光光度計或酶標儀預熱30min,調節(jié)波長到660nm,蒸餾水調零。
2. 將標準液用蒸餾水稀釋成0.1μmol/mL 磷標準溶液。
3. 加樣表:
試劑名稱(μL) | 對照管 | 測定管 | 標準管 | 空白管 |
試劑一 | 240 | 240 | ||
試劑二 | 260 | 260 | ||
試劑三 | 60 | 60 | ||
樣本 | - | 120 | ||
混勻后蓋緊,37℃水浴準確反應15min; | ||||
試劑四 | 300 | 300 | ||
樣品 | 120 | - | ||
混勻后,室溫(25℃左右)10000rpm,離心10min; | ||||
上清 | 500 | 500 | - | - |
磷標準品 | - | - | 500 | - |
蒸餾水 | - | - | - | 500 |
試劑五 | 500 | 500 | 500 | 500 |
混勻后蓋緊,45℃水浴10min,冷卻后測定660 nm處光吸收,盡快測完。計算ΔA測=A測定管-A對照管, ΔA標=A標準管-A空白管。 |
三、GAL活性計算:
(1)按蛋白濃度計算
活性單位定義:37℃下,每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol無機磷的GCL酶活量為1個酶活力單位。
GCL(U/mg prot)=[ΔA測÷(ΔA標÷C標準液)×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T
=0.0544×ΔA測÷ΔA標÷Cpr
(2)按樣品鮮重計算
活性單位定義:37℃下,每克樣品每分鐘催化產(chǎn)生1μmol無機磷的GCL酶活量為1個酶活力單位。
GCL(U/g鮮重)=[ΔA測÷(ΔA標÷C標準液)×V反總]÷(W÷V樣總×V樣)÷T
=0.0544×ΔA測÷ΔA標÷W
(3)按細胞數(shù)量計算
活性單位定義:37℃下,每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL(U/104 cell)=[ΔA測÷(ΔA標÷C標準液)×V反總]÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=0.0544×ΔA測÷ΔA標÷細胞數(shù)量
(4)按照液體體積計算
活性單位定義:37℃下,每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL(U/mL)= [ΔA測÷(ΔA標÷C標準液)×V反總]÷V樣÷T
=0.0544×ΔA測÷ΔA標
V反總:反應總體積,0.98mL;V樣:加入樣品體積,0.12mL;Cpr:上清液蛋白質濃度,mg/mL;T:反應時間,15min,C標準液:磷標準溶液濃度,0.1μmol/mL;V樣總:加入試劑一的體積,1mL;W:樣品鮮重,g;細胞數(shù)量:以104為單位計算,萬個。
注意事項:
(1)樣品處理等過程均需要在冰上進行,且須在當日測定酶活力,以免影響其活力。如果是勻漿液,避免反復凍融。
(2)樣本測定前先取1-2個樣做預實驗,如吸光值大于1,應先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當倍數(shù),哺乳動物組織和血液一般稀釋3~5倍。
(3)細胞中GCL活性測定時,細胞數(shù)目須在300萬-500萬之間,細胞中GCL的提取時可加試劑一(或生理鹽水)后研磨或超聲波處理,不能用細胞裂解液處理細胞。
(4)試劑三配制完成后,請一周內使用完。
(5)試劑五配制過程中,可能會產(chǎn)生黑色固體,其不影響結果,注意吸取時不要將黑色固體吸入。該溶液配制完成后應為淺黃色,若為藍色則已污染,不可再使用。
(6)測定吸光值時請于水浴后10~40分鐘內測完。
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