N-乙酰基-β-葡萄糖苷酶(NAG)活性檢測試劑盒
(可見分光光度法)
產品貨號:BA1934
產品規格:50T/24S
產品簡介:
N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.52,N-acetyl-β-D-glucosidase,NAG)廣泛分布于各種組織中,是一種細胞內溶體酶,測定NAG活性可用于腎小管間質性腎炎、尿路感染、糖尿病腎病綜合癥、高血壓腎病、腎移植后的排異反應和腎病綜合癥的早期診斷。
NAG分解N-β-乙酰氨基葡萄糖苷生成對-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通過測定400nm下吸光度的 變化來計算NAG活性。
注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
產品組成:
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體30mL×1瓶 | 2-8℃ |
試劑一 | 液體20mL×1瓶 | 2-8℃ |
試劑二 | 粉劑×2瓶 | -20℃ |
試劑三 | 液體60mL×1瓶 | 2-8℃ |
標準品 | 液體1mL×1支 | 2-8℃ |
溶液的配制:
1. 試劑二:臨用前取一瓶加入2.5mL蒸餾水溶解備用;可-20℃分裝保存4周,避免反復凍融;
2. 標準品:5μmol/mL的對硝基苯酚溶液。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、天平、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、超聲破碎儀、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、 研缽/勻漿器、EP管、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)
1. 組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取0.1g組織,加入1mL提取液),冰浴勻漿。15000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2. 細菌、細胞:先收集細胞或細菌樣本到離心管內,離心棄上清后,按照細胞數量104個:提取液體積(mL) 500~1000:1的比例,建議500萬細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細胞(冰浴,功率200w,超聲3s,間隔7s,總時間3min),然后15000g,4℃,離心10min,取上清,置冰上待測。
3. 血清(漿)等液體:直接測定。
二、測定步驟
1. 分光光度計預熱30min以上,調節波長至400nm,蒸餾水調零。
2. 標準溶液的稀釋:取125μL5μmol/mL對硝基苯酚溶液,加入875μL蒸餾水,充分混勻,配制成0.625μmol/mL 標準液使用,現用現配。(實驗中每管需要50μL,為減小實驗誤差,故配制大體積。)
3. 操作表 (在1.5mL離心管中依次加入下列試劑) :
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 |
試劑一 | 300 | 300 | 300 | 300 |
試劑二 | 150 | - | - | - |
蒸餾水 | - | 150 | 150 | 200 |
標準液 | - | - | 50 | - |
樣本 | 50 | 50 | - | - |
置于37℃水浴鍋或恒溫培養箱反應30min | - | - | ||
試劑三 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混勻后室溫放置2min,測定400nm的吸光度,分別記為A測定管、A對照管、A標準管、A空白管。計算ΔA測定=A測定管-A對照管,ΔA標準=A標準管-A空白管。每個測定管需設一個對照管。標準管和空白管只需測1-2次。
三、NAG活性計算
1. 按蛋白濃度計算
活力單位定義:每mg蛋白在反應體系中每分鐘生成1nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
NAG (U/mg prot) =ΔA測定÷(ΔA標準÷C標)×1000×V樣÷(Cpr×V樣)÷T=20.83×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr
2. 按樣本質量計算
活力單位定義:每g樣本在反應體系中每分鐘生成1nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
NAG (U/g 質量)=ΔA測定÷(ΔA標準÷C標)×1000×V樣÷(V樣÷V樣總×W)÷T=20.83×ΔA測定÷ΔA標準÷W
3. 按細胞數量計算
活力單位定義:每104個細胞在反應體系中每分鐘生成1nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
NAG (U/104cell)= ΔA測定÷(ΔA標準÷C標)×1000×V樣÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T
=20.83×ΔA測定÷ΔA標準÷細胞數量
4. 按液體體積計算
活力單位定義:每毫升液體在反應體系中每分鐘催化生成1nmol對硝基苯酚為一個酶活力單位。
NAG (U/mL)= ΔA測定÷(ΔA標準÷C標)×1000×V樣÷V樣÷T=20.83×ΔA測定÷ΔA標準
C標:標準溶液濃度:0.625μmol/mL;V樣:加入的樣本體積,0.05mL;V樣總:提取液體積,1mL;Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL;T:反應時間,30min;細胞數量:以萬計;W:樣本質量,g;1000:換算系數, 1μmol=1000nmol。
注意事項:
吸光度若大于1.2時,建議將樣本用提取液稀釋后進行測定。
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