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乳酸含量(LA)檢測試劑盒(微量法)
產品貨號:BA1259
產品規格:100管/48樣
產品簡介:
乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產物,與糖代謝、脂類代謝、蛋白質代謝及細胞內能量代謝密切相關,乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸,同時使NAD+還原生成NADH和H+,H+傳遞給PMS生成的PMSH2還原MTT生成紫色物質,在570nm處有特征吸收峰。
技術指標:
檢出限:0.0771μmol/mL
線性范圍:0.078-5μmol/mL
注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者 增加樣本量進行檢測。
產品組成:
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體50mL×1瓶 | 4℃ |
提取液二 | 液體8mL×1瓶 | 4℃ |
試劑一 | 液體6mL×1瓶 | 4℃ |
試劑二 | 液體34μL×1支 | 4℃ |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | -20℃ |
試劑四 | 粉劑×1瓶 | 4℃ |
試劑五 | 粉劑×1瓶 | -20℃ |
試劑六 | 液體2mL×1瓶 | 4℃ |
標準品 | 粉劑×1支 | 4℃ |
溶液的配制:
1. 試劑二:液體置于試劑瓶內EP管中。臨用前按試劑二(V):蒸餾水(V)=10μL:450μL的比例配制試劑二溶液,現用現配;
2. 試劑三:臨用前加入4mL蒸餾水充分溶解,可分裝后-20℃保存,避免反復凍融,-20℃保存一周;
3. 試劑四:臨用前加4mL蒸餾水充分溶解,4℃保存一周;
4. 試劑五:臨用前每瓶加入3mL蒸餾水混勻,可分裝后-20℃保存,避免反復凍融,-20℃保存一周;
5. 標準品:臨用前加入1.04mL蒸餾水配成100μmol/mL的標準溶液;
6. 顯色液的配制:臨用前根據用量按照試劑三(V):試劑四(V)=1:1的比例充分混勻,現配現用。
需自備的儀器和用品:
天平、研缽/勻漿器、離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、乙醇和蒸餾 水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)
1. 組織:按照質量(g):提取液一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液一)加入提取液一,冰浴勻漿后于4℃,12000g離心10min,取0.8mL上清液,再加入0.15mL提取液二,4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
2. 細胞:按照細胞數量(104個):提取液一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);于4℃,12000g離心10min,取0.8mL上清液,再加入0.15mL提取液二,4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
3. 血清(漿):取100μL血清(漿)加入1mL提取液一,4℃ 12000g離心10min,取0.8mL上清液,再加入0.15mL提取液二,12000g離心10min后取上清待測。
二、測定步驟
1. 分光光度計/酶標儀預熱30min以上,波長調至570nm,分光光度計用乙醇調零。
2. 標準液的稀釋:將100μmol/mL的標準溶液用蒸餾水稀釋為2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL的標準溶液待測。
3. 加樣表:
測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 | |
樣本(μL) | 10 | 10 | - | - |
標準品(μL) | - | - | 10 | - |
蒸餾水(μL) | - | 10 | - | 10 |
試劑一(μL) | 40 | 40 | 40 | 40 |
試劑二(μL) | 10 | - | 10 | 10 |
試劑五(μL) | 20 | 20 | 20 | 20 |
在EP管中充分混勻,于37℃水浴準確反應20min。 | ||||
試劑六(μL) | 6 | 6 | 6 | 6 |
顯色液(μL) | 60 | 60 | 60 | 60 |
37℃避光反應20min后于25℃,10000rpm離心10min,去上清,留沉淀。 | ||||
乙醇(μL) | 200 | 200 | 200 | 200 |
充分溶解沉淀后,于570nm處測定吸光值,分別記為A測定管,A對照管,A標準管,A空白管,計算ΔA測定=A測定管-A對照管;ΔA標準= A標準管-A空白管。 |
三、乳酸含量的計算
標準曲線的繪制
1. 以各標準溶液濃度為x軸,以其對應的吸光值(ΔA標準)為y軸,繪制標準曲線,得到標準方程y=kx+b,將ΔA測定帶入公式中得到x(μmol/mL)。
2. 乳酸含量計算
(1)按照樣本蛋白濃度計算
LA含量(μmol/mg prot)=x×V樣本÷(V樣本×Cpr)=x÷Cpr
(2)按照樣本質量計算
LA含量(μmol/g質量)=x×(V上清+V提取液二)÷(W×V上清÷V提取液一)=1.1875×x÷W
(3)按照細胞數量計算
LA含量(μmol/106 cell)=x×(V上清+V提取液二)÷(5×V上清÷V提取液一)=0.2375×x
(4)按照液體體積計算
LA含量(μmol/mL)=x×(V上清+V提取液二)÷ [V液體×V上清÷(V提取液一+V液體)]=13.0625×x
V樣本:加入的樣本體積,0.01mL;W:樣本質量,g;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL,蛋白濃度需自行測定;V上清:提取時上清液體積,0.8mL;V提取液二:加入提取液二的體積,0.15mL;V提取液一:加入的提
取液一體積,1mL;5:細胞數量,5×106個;V液體:液體樣本體積,0.1mL。
注意事項:
如果測定吸光值超過線性范圍吸光值,可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。
實驗實例:
1. 取0.1g兔心加入1mL提取液一進行勻漿研磨離心,取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,離心取上清后稀釋5倍,之后按照測定步驟操作,使用96孔板測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.591-0.069=0.522,根據標準曲線 y=0.412x-0.0214,x=1.319,按樣本質量計算含量得:
LA含量(μmol/g質量)=1.1875×x÷W×稀釋倍數=1.1875×1.319÷0.1×5=78.32μmol/g質量。
2. 取100μL小鼠血清加入1mL提取液一,取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,離心取上清,之后按照測定步驟操作,使用96孔板測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.572-0.211=0.361,根據標準曲線y=0.412x-0.0214,x=0.928,按照液體體積計算含量得:
LA含量(μmol/mL)=13.0625×x=13.0625×0.928=12.122μmol/mL。
相關發表文獻:
[1] Meixi Peng,Dan Yang,Yixuan Hou,et al.Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis. Cell Death and Disease. March 2019;(IF5.959)
[2] Xiaojin Luo,Weihua Shi,Haoming Yu,et al. Wearable Carbon Nanotube-Based BioSensors on Gloves for Lactate. Sensors. October 2018;(IF3.031)
[3] Zhou F, Du J, Wang J. Albendazole inhibits HIF-1α-dependent glycolysis and VEGF expression in non-small cell lung cancer cells[J]. Molecular and cellular biochemistry, 2017, 428(1-2): 171-178.
參考文獻:
Eolbergrová J, MacMillan V, Siesj? B K. The effect of moderate and marked hypercapnia upon the energy state and upon the cytoplasmic NADH/NAD+ ratio of the rat brain[J]. Journal of neurochemistry, 1972, 19(11): 2497-2505.
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