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磷酸果糖激酶(PFK)活性檢測(cè)試劑盒(紫外分光光度法)

時(shí)間:2024/7/15閱讀:138
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磷酸果糖激酶(PFK)活性檢測(cè)試劑盒(紫外分光光度法)

產(chǎn)品貨號(hào):BA1194

 

產(chǎn)品規(guī)格:50/48

 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

PFKEC 2.7.1.11)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,負(fù)責(zé)將果糖-6-磷酸和ATP轉(zhuǎn)化為果糖-1,6 二磷酸和ADP,是糖酵解過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下測(cè)定NADH下降速率,即可反映PFK活性。

注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

 

產(chǎn)品內(nèi)容:

試劑名稱(chēng)

規(guī)格

保存條件

提取液

液體60 mL×1

2-8

試劑一

液體40 mL×1

2-8

試劑二

粉劑×1

-20

試劑三

液體45μL×1

-20

試劑四

液體20μL×1

2-8

溶液的配制:

1. 試劑二:臨用前加入2.8mL雙蒸水充分溶解備用;-20℃分裝保存一周;

2. 試劑三:液體置于試劑瓶?jī)?nèi)EP管中。臨用前根據(jù)用量按照試劑三:蒸餾水為2:13 的體積比例充分混勻, 現(xiàn)用現(xiàn)配;用不完的試劑三原液建議-20℃分裝保存,避免反復(fù)凍融;

3. 試劑四:液體置于試劑瓶?jī)?nèi)EP管中。臨用前根據(jù)用量按照試劑四:蒸餾水為4:65的體積比例充分混勻,現(xiàn)用現(xiàn)配; PFK工作液(可測(cè)25個(gè)樣)的配制:取19mL試劑一和1.26mL試劑二充分混勻,現(xiàn)用現(xiàn)配。

 

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

 

操作步驟

一、樣本的前處理 

1. 細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備

細(xì)菌或細(xì)胞處理:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率20%,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

組織處理:稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿;8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2. 血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 操作表

試劑名稱(chēng)(μL

測(cè)定管

PFK工作液

800

樣本

30

試劑三

5

試劑四

5

將上述試劑按順序加入1mL石英比色皿中,加樣本的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí);在340nm波長(zhǎng)下記錄20秒時(shí)的初始吸光度A1,比色后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴中,準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘;迅速取出比色皿并擦干,340nm下比色,記錄1020秒時(shí)的吸光度A2,計(jì)算?A=A1-A2

三、PFK活力單位的計(jì)算:

1. 血清(漿)PFK活力的計(jì)算:

單位的定義:每毫升血清(漿)在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個(gè)酶活力單位。

PFKU/mL=[△A×V反總÷ε×d×109 ] ÷V÷T=450×△A

2. 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PFK活力的計(jì)算:

1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個(gè)酶活力單位。

PFKU/mg prot)=[△A×V反總÷ε×d×109 ] ÷(Cpr×V)÷T=450×△A ÷Cpr

2) 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP定義為一個(gè)酶活力單位。

PFKU/g 鮮重)=[△A×V反總÷ε×d×109 ] ÷(W×V÷V樣總)÷T=450×△A ÷W

3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個(gè)酶活力單位。

PFKU/104 cell)=[△A×V反總÷ε×d×109 ] ÷(500×V÷V樣總)÷T=0.9×△A

V反總:反應(yīng)體系總體積,8.4×10-4LεNADH 摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.03mLV樣總:加入提取液體積,1mLT:反應(yīng)時(shí)間,10minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn);109:?jiǎn)挝粨Q算系數(shù),1mol=109nmol

 

注意事項(xiàng):

1. 測(cè)定過(guò)程中試劑三、試劑四和樣本在冰上放置,以免變性和失活。

2. 比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃25℃,取小燒杯一只裝入一定量的37℃25℃蒸餾水,將此燒杯放入37℃25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

3. 好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn),一個(gè)人比色,一個(gè)人計(jì)時(shí),以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4. ?A大于0.5,需將酶液用酶提取液稀釋?zhuān)?/span>?A小于0.5,可提高檢測(cè)靈敏度。

 

 

 


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