自備材料：

1. 胰蛋白酶消化液

2. 流式細(xì)胞儀

3. PBS

4. 預(yù)冷固定液：預(yù)冷的70%乙醇或4%多聚甲醛

操作步驟（僅供參考）：

1. 細(xì)胞樣品的制備：

⑴貼壁細(xì)胞：

① 小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一個無菌離心管內(nèi)備用。

② 用胰蛋白酶消化細(xì)胞至可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的 貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。

③ 收集上述細(xì)胞懸液到離心管內(nèi)。

④ 4℃，1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細(xì)胞。

⑤ 加入約1ml提前預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌離心管。

⑥ 4℃，1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。

⑦ 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS，以免吸走細(xì)胞。

⑧ 輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

⑵懸浮細(xì)胞：

① 4℃，1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。

② 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細(xì)胞。

③ 加入約1ml提前預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌離心管。

④ 4℃，1000g 離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。

⑤ 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS，以免吸走細(xì)胞。

⑥ 輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

2. 細(xì)胞的固定：

 加入1ml冰浴預(yù)冷70%乙醇中，輕輕吹打混勻，4℃條件下固定2h或更長時(shí)間。4℃固定12～24h 可能效果更佳。

3. 細(xì)胞的清洗：

①4℃，1000g 離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。

② 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl溶液，以免吸走細(xì)胞。

③ 加入約1ml提前預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌離心管。

④4℃，1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。

⑤ 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS，以免吸走細(xì)胞。

⑥ 輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

4. PI染色：

 在每個待檢細(xì)胞樣品中加入500μl配制好的PI染色工作液，輕輕重懸細(xì)胞沉淀，置于37℃避光水浴 30min。

5. 檢測與分析：

 用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光，同時(shí)檢測光散 染色結(jié)果： 凋亡細(xì)胞G1峰左側(cè)出現(xiàn)亞二倍體細(xì)胞群的峰型，在光散射譜上，前向光散射低于正常，側(cè)向光散射高于正常。

注意事項(xiàng)：

1. 熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。

2. 為減緩熒光淬滅可以使用抗熒光淬滅封片液。

3. 在為了獲得細(xì)胞沉淀的離心的過程中，對于特殊細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)提高離心力或延長離 心時(shí)間。

4. 如果用于組織的細(xì)胞周期不細(xì)胞凋亡檢測，則必須把組織消化后，制備成單細(xì)胞懸液，才可以進(jìn)行檢測。

5. 細(xì)胞凋亡時(shí)，凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一是DNA可染行降低，但這種情況并是的，DNA含量的降低或者 DNA 與染料結(jié)合能力下降也會導(dǎo)致 DNA 可染行降低，在分析的時(shí)候應(yīng)特別注意。

6. PI對人體有一定刺激性，請注意適當(dāng)防護(hù)。

7. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

有效期： -20℃儲存，6個月有效。4℃儲存, 1 個月有效。