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RT-PCR的靈敏度低2023/6/30
可能原因1：RNA問題（包括：RNA被損害和降解；初始模板RNA不充分）。解決方法：如果全損害或者降解的話，更換RNA；增加模板RNA的濃度；使用10ng-1μg的總RNA。可能原因2：儀器故障。解決...
RT-PCR的非特異信號2023/6/30
可能原因1：引物問題（包括：引物二聚體太多）。解決方法：檢查引物設(shè)計環(huán)節(jié)和合成環(huán)節(jié)，必要時重新設(shè)計和合成引物。可能原因2：擴增酶問題。解決辦法：選擇hotstartTaq酶進(jìn)行擴增，可提高靈敏度，增加...
RT-PCR的無擴增產(chǎn)物2023/6/30
可能原因1：引物問題（包括：引物設(shè)計較差，引物合成較差，引物濃度太低）。解決方法：設(shè)計引物的時候，避免在引物3'端含有互補序列；避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列；設(shè)計Tm類似的引物。針對引物合成的問題，...
消滅 PCR 非特異性擴增的方法2023/6/28
非特異性擴增，即進(jìn)行PCR所擴增出來的條帶不是所要的，引物與模板在非目的條帶處有錯配，導(dǎo)致延伸產(chǎn)物不是目的條帶。例如引物二聚體，即引物在退火過程中產(chǎn)生了hairpin結(jié)構(gòu)或其他二級結(jié)構(gòu)，或者引物在模板...
DNA 復(fù)制需要哪些元素2023/6/28
1)需要脫氧核苷三磷酸：進(jìn)行DNA合成必須具備的2個關(guān)鍵底物之一，即4種脫氧核苷三磷酸——dGTP、dCTP、dATP、dTTP。通常商品化PCR酶會提供這4種脫氧核苷三磷酸的混合物dNTP。2)需要...
miRNA 成熟過程中的關(guān)鍵性酶和蛋白2023/6/27
RNApolymeraseII：一般認(rèn)為miRNA基因由RNApolymeraseII轉(zhuǎn)錄而來。可將miRNA基因轉(zhuǎn)錄成5'端蓋帽m7G和3‘端加尾polyA結(jié)構(gòu)。Drosha：Drosha蛋白為RN...
lncRNA 的生物學(xué)功能（二）2023/6/27
一）lncRNA對于細(xì)胞周期及凋亡的調(diào)控作用有研究報道，lncRNA可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡的方式，來影響細(xì)胞的增殖。例如，Gas5（growtharrest-specific5，非編碼RNA）在細(xì)...
lncRNA 的生物學(xué)功能（一）2023/5/17
（一）lncRNA對于細(xì)胞周期及凋亡的調(diào)控作用有研究報道，lncRNA可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡的方式，來影響細(xì)胞的增殖。例如，Gas5（growtharrest-specific5，非編碼RNA）在...
構(gòu)建載體2023/5/5
構(gòu)建載體最關(guān)鍵的一步就是設(shè)計引物引入酶切位點，一旦引物設(shè)計好，那接下來就非常簡單了，今天重點就來教教大家如何利用snapgene輕松獲得構(gòu)建載體所需的引物序列。1.打開軟件，選擇第一個（紅線標(biāo)記），然...
引物設(shè)計原則2023/5/5
1）擴增產(chǎn)物長度100bp-150bp為佳；2）引物長度17bp-25bp最好；3）正向引物和反向引物的Tm值最好相差不要超過1℃。Tm值調(diào)整至60℃-65℃為佳；4）引物的GC含量控制在40%-60...
PCR 操作中必知的 6 大細(xì)節(jié)2023/5/5
1、最好使用一次性進(jìn)口tip頭，以避免液體殘留；同時，tip頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。2、加樣時，tip頭要伸入PCR反應(yīng)管的液面下一點，然后將液體緩緩打入液面下，至恰好打出一個小氣...
PCR 引物設(shè)計2023/5/5
好的引物會讓PCR實驗成功一半，因而，引物設(shè)計一直都是PCR非常重要的環(huán)節(jié)。經(jīng)典之法就是讓Premier5攜手oligo，共同設(shè)計PCR引物。1、以小鼠的IL-17為例，進(jìn)入NCBI界面,選擇Nucl...
PCR 產(chǎn)物純化2023/4/21
材料與儀器TE或去離子水PCR產(chǎn)物離心機和轉(zhuǎn)子PCR濾件微量離心管步驟一、材料1.緩沖液和溶液TE(lOmmol/LTris-HCl，lmmol/LEDTA，pH7.5)或去離子水2.核酸和寡核苷酸待...
DNA 污染的柱上去除2023/4/21
材料與儀器DNA酶I緩沖液DNA酶I細(xì)胞裂解液步驟一、材料1.酶和酶緩沖液DNA酶I，擴增級（無RNA酶）DNA酶I緩沖液，10X2.細(xì)胞和組織利用總RNA純化試劑盒（例如Madigen總RNA快速純...
冷凍組織及切片的準(zhǔn)備2023/4/21
材料與儀器1、新鮮的組織2、丙酮蒸餾水干冰磷酸鹽緩沖液（PBS)TekOCT組織復(fù)合物3、封閉容器燒杯恒冷裝置解剖工具平盤組織模子載玻片刀片步驟一、材料1.緩沖液、溶液和試劑丙酮蒸餾水干冰磷酸鹽緩沖液...
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