概述

體內細胞不斷受到多種微環境對細胞功能的機械刺激的調節。雖然前人已經建立了二維細胞對機械刺激的反應模型，但這些方法缺乏相關性，因為生理細胞微環境是三維的。此外，現有的用于研究細胞對三維機械線索的反應的平臺要么提供低通量，涉及復雜的制造，要么不允許對多個線索進行組合分析。考慮到這一點，提出了一種可拉伸的高通量(HT)三維細胞微陣列平臺，該平臺可以將動態機械應變應用于封裝在排列的三維微凝膠中的細胞。該平臺使用生物打印技術，在周期性拉伸的彈性復合基底上打印含細胞的甲基丙烯酸明膠(GelMA)微凝膠陣列。所開發的平臺具有高度的生物相容性，并將所應用的細胞從拉伸的底物轉移到細胞中。HT分析用于分析整個打印微凝膠陣列的細胞機械反應。并對不同的細胞行為進行了組合分析。

1，介紹

體內細胞不斷受到多種微環境刺激，包括生化信號、生物力學場、細胞外基質(ECM)或底物剛度，以及細胞相互作用。細胞的命運、功能和反應是受到所有這些微環境線索對細胞的聯合效應的高度調節。細胞對單個微環境因子的反應已被各種研究很好地描述出來。然而，這些因素之間存在相互作用（同時調節細胞功能），因此評估細胞對多種微環境線索的協同效應的反應將受益于組合和高通量(HT)方法。

細胞微陣列作為HT平臺之一，允許對多種微環境信號的細胞行為進行快速、多重的研究。大多數平臺主要集中在篩選可溶性生化因子和ECM蛋白，只有少數存在篩選機械刺激，這中機械刺激是非常重要的，因為細胞在體內意義和響應各種機械刺激通過機械轉導。例如，在血管系統中，內皮細胞同時經歷剪切應力和剪切應變，平滑肌細胞同時經歷周向拉伸拉伸和壓縮應變。此外，心臟和肺中的細胞暴露在拉伸應力和應變下，而骨和軟骨組織中的細胞則受到壓縮應力-應變的影響。

一些用于篩選細胞機械反應的細胞微陣列平臺已經被開發出來，認識到細胞機械刺激在調節許多組織的發育和病理條件中的重要性。這些平臺的初版本能夠評估2D細胞培養的機械反應。然而，這種方法缺乏生理相關性，因為3D的細胞行為與2D的*不同。由于這個原因，我們開發了能夠為細胞創造3D環境的平臺。功能水凝膠由于具有高度的生物相容性和支持細胞生長，已被廣泛應用于組織工程應用。3D微環境是通過將細胞封裝在功能性水凝膠支架中，并將其作為為陣列，然后在培養過程中引入刺激。然而，目前只有少數平臺證明了擁有篩選3D細胞對機械刺激的反應的能力。Moraes等人設計了一個應用不同壓力到凝膠陣列的微流控平臺。類似地，Liu等人開發了一種微制造平臺，通過對充滿細胞的聚乙二醇水凝膠陣列施加動態拉伸應變，可以對細胞進行三維機械刺激。近，Li等人展示了一種陣列平臺，可以磁性驅動暴露在極限靜態拉伸應變下的細胞內甲基丙烯酸酯明膠(GelMA)水凝膠。盡管他們在評估3D細胞對機械應力和應變的反應方面采用了創新的方法，但這不允許篩選細胞對其他微環境刺激的綜合反應，認為這是一個低通量系統。Seo等人報道了一種可相互連接的生物反應器，該反應器允許HT篩選連續介質灌注下的凝膠凝膠水凝膠成分和動態壓縮應變對干細胞成骨分化的組合效應。雖然這個平臺允許HT研究多種線索對細胞的聯合影響，但它涉及到復雜而費力的制造過程。此外，帶圖案的細胞式水凝膠是毫米級的，因此需要大量的水凝膠。此外，本研究的結果顯示，干細胞的成骨分化增強，沒有顯示出任何其他細胞向拉伸方向的行為，這是外部機械刺激作用細胞時常見的觀察。

在本文中，我們報道了一個可伸縮的三維細胞微陣列平臺，具有簡單的制造步驟和提高的吞吐量容量。所開發的平臺是由三維生物打印成纖維細胞負載的GelMA微凝膠陣列結合在彈性復合膜基質上組成。使用定制的單軸動態拉伸器對平臺進行動態單軸拉伸，以研究細胞對機械應變的響應。研究了該平臺的生物相容性因素，如細胞活力、擴散和增殖等。作為概念的證明，與非拉伸對照組相比，使用細胞成像技術表征了細胞對動態機械拉伸的反應。在開發的平臺上打印不同濃度的成纖維細胞GelMA微凝膠，對不同細胞微環境對機械刺激進行組合分析。在對照組和拉伸組中，分析了單個水凝膠濃度下的細胞擴散和取向。可伸縮微陣列平臺使細胞以HT方式機械刺激，也促進了細胞機械反應的組合篩選。該平臺還可以擴大規模，引入廣泛的細胞外線索，并以HT的方式篩選細胞反應和3D組織的形成。我們相信，所開發的平臺將為篩選各種生物材料參數提供一個很有前途的解決方案，用于細胞生長和調節細胞功能（特別是干細胞分化），以模擬更現實的生理環境。

2.平臺制備（略）

3.不同濃度和硬度細胞微陣列打印和培養（略）

4.拉伸測試（略）

5實驗結果分析

6 結論

動態應變響應細胞排列的機制

一些細胞類型，特別是收縮細胞(包括成纖維細胞、平滑肌細胞、心肌細胞和人間充質干細胞(hMSCs))，已經證明能對外部動態刺激作出反應。一般來說，當暴露于靜態或動態拉伸時，3D水凝膠中的細胞與拉伸軸對齊。當我們的平臺以1hz的頻率以10%的應變率拉伸3天時，6%GelMA芯片內的細胞也平行于拉伸方向，這一結果與現有文獻一致。平行細胞與應變方向（3D水凝膠結構）的機制尚不*了解。然而，基于現有的理論，在拉伸的6%GelMA微凝膠的核心區域的平行細胞對齊可以在單細胞和多細胞水平上進行解釋。

在單個細胞水平上的細胞對齊

初，細胞通過接觸引導進行伸長和排列，這種現象是指細胞和肌動蛋白絲（細胞內的應力纖維）的取向主要由襯底的幾何線索或襯底內的纖維決定(在3D水凝膠/靜電紡絲纖維的情況下)。ECM纖維初與循環拉伸方向對齊，通過接觸引導機制促進細胞沿著纖維的方向對齊。先前的研究表明，軟膠原原纖維傾向于沿著應變施加的方向排列。因此，當將外部應變施加于我們的GelMA微凝膠時，微凝膠纖維可能已經向拉伸方向排列，這反過來可能要求細胞向類似的方向排列。

由于交聯微凝膠陣列中的GelMA纖維初是隨機的，并且沒有暴露在任何動態機械拉伸條件下，細胞排列也是隨機的，這也是一種接觸引導現象。使用掃描電鏡可以看到纖維的排列；然而，凍干過程可能會影響微凝膠，凍干平臺的處理并不容易。

在3D水凝膠中，細胞不斷地改變其形狀，并與微環境機械地相互作用，以遷移或響應外力。這種細胞與其微環境相互作用的動態過程被稱為黏合斑(FA)成熟，在此過程中，細胞不斷地重塑其細胞骨架、周圍的ECM網絡，并通過FA（細胞機械轉導的主要樞紐）與ECM的連接。這一過程也有助于細胞通過ECM纖維網絡的遷移。一般來說，細胞對周圍的水凝膠纖維網絡施加收縮力，并在纖維拉長時收縮纖維。收縮力在基質內引起局部張力力，與細胞的收縮力保持平衡，從而保持平衡。

當一個外部動態應變被施加到一個富含細胞的水凝膠上時，它會在整個水凝膠中產生一個整體應變，從而導致纖維中的張力增加。為了保持系統平衡，細胞通過肌動球蛋白收縮過程增加收縮力。細胞收縮力的增加增加了細胞內的張力，并產生了成束的應力纖維（肌動蛋白絲），促進其FA成熟和向拉伸方向延伸/偽足的形成。此外，細胞的高收縮性導致水凝膠纖維的局部緊實應變增加；然而，細胞傾向于避免任何壓力/應變。

6%GelMA微陣列的楊氏模量為6.6 kPa，通常被認為是柔順性水凝膠。由于成纖維細胞本質上具有高度收縮性，它促進了FA成熟，并沿拉伸方向產生大量應力纖維。它還會產生較高的局部橫向壓實應變（由于6%GelMA的順應性），其大小大于施加的應變。一方面避免局部應變，另一方面FA成熟過程的增加會導致6%GelMA微陣列中的成纖維細胞平行于拉伸方向重新定向。

在多細胞水平上的細胞對齊

上述理論描述了單個成纖維細胞如何沿著拉伸方向排列。然而，多細胞水平上的細胞排列分為三個階段。先，單個細胞自身與拉伸方向平行排列，然后細胞在平行的方向上彼此排列。隨后，細胞相互關聯，形成一個與拉伸軸平行的繩狀結構。細胞之間的緊密結合是高收縮性、FA成熟和避脅變性的結果。這種繩狀結構使細胞看起來更細長，這可能是我們觀察到包裹在6%拉伸GelMA微凝膠陣列中的成纖維細胞比6%對照GelMA微陣列中隨機排列的細胞具有更高伸長程度的原因（圖S2B，支持信息）。另一個重要的觀察結果是，繩狀結構主要出現在相對濃度較小的GelMA微凝膠中（圖S2A-i，支持信息）。這是因為當細胞密度很高時，細胞間相互作用的幾率很高所有方向都會發生粘附，防止形成清晰的繩狀結構。當細胞間的粘附力更強時，細胞有可能形成網狀圖案。因此，在未來，在生物打印過程中控制細胞密度可以改善整個拉伸GelMA微陣列中繩狀結構的形成。

細胞遷移能力與隨機水凝膠纖維內的排列

細胞與拉伸方向的排列需要細胞在水凝膠內遷移。因此，細胞遷移是使細胞朝向施加應變方向重新定向的主要因素之一。細胞在3D水凝膠中的遷移可以用吊索短遷移（SSM）理論來解釋。如前所述，成纖維細胞通過接觸導向機制沿著水凝膠纖維伸出并極化。在此過程中，細胞經歷肌動球蛋白收縮，并招募附近的水凝膠纖維來儲存其彈性應變能。當施加外部應變時，其超過纖維張力，從而導致FA失效或接觸細胞后緣。隨后，纖維發生反沖，在此過程中，儲存的彈性能被釋放并轉移到細胞中，使其朝拉伸方向移動。細胞的SSM主要在排列的纖維中觀察到，而不是在隨機纖維中觀察到。因此，細胞重新定向可能是這兩種理論的協同效應——水凝膠纖維向拉伸方向排列、避脅變性以及由于高肌動球蛋白收縮性而導致的更強ECM成熟。

沿GelMA微凝膠邊界的周向細胞排列

控制細胞重定向的其他因素是應變率、頻率、拉伸條件的持續時間和水凝膠的幾何形狀。從我們的結果來看，主要的重定向只觀察到在GelMA微凝膠的核心區域；然而，細胞沿著其邊界呈圓周排列。幾何效應和施加的拉伸應變之間的競爭可能是導致核心和外圍區域的細胞排列不同的原因。在GelMA微凝膠的邊界上，幾何效應(來自半球形的GelMA微凝膠)可以主導施加的拉伸應變，導致細胞沿周向對齊。同樣，在核心區域，拉伸應變主導了幾何效應，并重新定向了平行于應變的細胞。

不同剛度微環境中的離散細胞對齊

SSM理論的另一個重要結果是，細胞遷移的程度高度依賴于水凝膠基質的剛度。

此外，水凝膠剛度影響水凝膠內水凝膠纖維收縮、細胞收縮性、FA成熟度和橫向壓縮應變的水平，這就提出了一個問題，即當細胞封裝在不同硬度的微環境水凝膠中循環拉伸時會如何反應。為了檢查水凝膠微環境剛度和循環應變的組合效應，我們將6%、8.5%和11%的GelMA微凝膠打印在相同的復合膜基底上，然后以1Hz頻率施加10%的應變，持續三天。

由于我們遵循GelMA合成的標準方案，且甲基丙烯酸化程度相似，因此我們沒有測試水凝膠的降解性和溶脹率。許多以前的研究都很好地描述了這一點。由于我們的GelMA的甲基丙烯酸化率很高，約為91%，由于交聯程度較高，我們預計GelMA的降解速度比之前研究中報告的要慢。在實驗過程中或實驗結束時，我們沒有觀察到打印的含有細胞的GelMA微凝膠的大小和形狀有任何顯著變化。水凝膠的可降解性總是與其剛度成反比。細胞在水凝膠內附著和增殖，形成3D細胞網絡，從而降解水凝膠。細胞附著和伸長的能力取決于水凝膠的硬度。在較軟的水凝膠中，成纖維細胞可以通過在3D環境中輕松牽引水凝膠纖維來牽引和拉長水凝膠纖維，從而局部降解水凝膠纖維。由于細胞不能在致密的微凝膠基質中伸長和增殖，因此細胞在堅硬的水凝膠中保持圓形，從而降低水凝膠的降解率。同樣，水凝膠的剛度也會影響水凝膠的溶脹率。水凝膠濃度越高，水凝膠網絡的交聯密度越高，這限制了水的滲透速度和滲透量，進而減緩了水凝膠的降解。

基于上述假設，我們希望觀察細胞排列趨勢的差異。正如預測的那樣，隨著GelMA濃度的增加，我們觀察到水凝膠的機械強度增加，孔徑減小。幾何效應在微凝膠的周邊區域占主導地位，與GelMA的濃度和硬度無關，因此在所有三種情況下，細胞都沿圓周方向排列。然而，我們分別在6%、8.5%和11%拉伸富含細胞的GelMA微陣列的核心區域觀察到平行、混合和垂直細胞取向。基于上述假設，細胞取向的這些差異可以再次得到解釋：隨著GelMA硬度的增加，細胞的收縮力不足以牽引和拉伸更硬的纖維。因此，由于細胞產生的收縮力較小，纖維中的張力較小，這顯著降低了微凝膠中的局部橫向壓縮應變。此外，較硬的GelMA不會發生大量變形，導致壓縮應力和應變沿著外部施加應變的方向發展。

在拉伸方向上增加的壓縮應力和應變會導致細胞避開拉伸方向，因此在8.5%（中等硬度）和11%GelMA（高硬度）微凝膠的情況下，細胞會在混合和垂直方向上對齊。

細胞遷移能力也受到水凝膠硬度的影響。根據SSM理論，較軟的水凝膠（6 kPa）中的細胞遷移速度比較硬的水凝膠快五倍（我們6%的凝膠硬度為6.6 kPa）。較硬纖維中缺乏張力會減少儲存的彈性能，從而降低細胞遷移率。當復合膜以10%的應變拉伸時，我們還模擬了具有不同壓縮楊氏模量的GelMA微凝膠中的應力分布。隨著楊氏模量的增加，我們觀察到微凝膠表面頂部沿拉伸方向和徑向的應力水平增加（圖S3，支持信息）。因此，模擬結果與我們關于細胞排列的假設一致。

除了細胞重新定向外，周期性拉伸使細胞能夠形成高度接近體內條件的結構，并提高其分化能力和功能。這可能是觀察到大量細胞在硬水凝膠中伸長和重新定向（拉伸時）的原因，這表明細胞經歷了應變。然而，未拉伸的更硬的GelMA微凝膠（8.5%和11%）內的細胞沒有太長。這些結果也與現有文獻[32]一致，表明細胞不會在較硬的3D水凝膠中附著、伸長和增殖。一種可能的解釋是，溶解度因子的擴散速率受到更硬的水凝膠中較小孔徑的高度影響。

因此，在較硬的非拉伸微凝膠周圍的細胞似乎伸長，因為它們具有大的擴散。細胞保持圓形的另一個原因可能是它們無法降解較硬的微凝膠基質。此外，剛性微凝膠纖維的也很難讓細胞附著和伸長。然而，我們推測，動態刺激（在我們的例子中是循環拉伸）增強了更硬水凝膠內的細胞擴散，這與其他類似研究一致。進一步研究細胞功能，如機械傳導和細胞間信號，以及拉伸和控制富含細胞的GelMA微凝膠陣列，將有助于確定存在機械刺激時水凝膠微環境特性對細胞行為的影響。

本實驗拉伸平臺和不同硬度的凝膠由MACH-1多功能微觀力學測試儀進行自動高通量壓痕測試得到楊氏模量。極大的方便了科學實驗的進行和分析。

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