目錄:優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司>>科研試劑盒>>PCR試劑盒>> 轉(zhuǎn)基因大豆EPSPS基因核酸檢測試劑盒
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | YLK10330P | 應用領域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
| 主要用途 | 科研實驗 | 保存條件 | -20℃±5℃，避光保存 |
| 有效期 | 12個月 | 英文名稱 | EPSPS Gene Detection Kit (Real-Time PCR Method) |
| 標本采集 | 稱取 200g 樣品 | EPSPS 反應液 | 500μL×2 管 |
轉(zhuǎn)基因大豆EPSPS基因核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：轉(zhuǎn)基因大豆EPSPS基因核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
Name ：EPSPS Gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預期用途】
5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)可以阻斷草甘膦對生物合成途徑的干擾，從而使菌種或植物不被草甘膦殺滅。因此，農(nóng)作物中轉(zhuǎn)入該基因，增加農(nóng)作物對草甘膦抗性，使草甘膦只作用于雜草，而不影響作物生長。熒光 PCR 技術因其靈敏度高、特異性強等特點，在轉(zhuǎn)基因檢測中發(fā)揮了重要作用。
本試劑盒適用于檢測轉(zhuǎn)基因植物的 EPSPS 基因，用于篩查待檢測植物中是否含有 EPSPS 成分。
【檢驗原理】
本試劑盒根據(jù) EPSPS 基因序列設計特異性的引物和探針[1-3]，用熒光 PCR 技術進行轉(zhuǎn)基因成分的檢測。
【試劑組成】
名 稱 | 規(guī) 格 |
酶液 | 50μL×1 管 |
EPSPS 反應液 | 500μL×2 管 |
EPSPS 陽性質(zhì)控品 | 50μL ×1 管 |
陰性質(zhì)控品 | 250μL ×1 管 |
注：
1） 不同批號試劑不能混用。
2） 試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù)。
【儲存條件及有效期】
-20℃避光保存、運輸、避免反復凍融，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
稱取 200g 樣品。
【保存和運輸】
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 0℃冰壺。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1 樣本前處理
固體樣本：用粉碎機或冷凍研磨儀將樣品研磨至細粉狀。
1.2 DNA 提取
推薦采用公司生產(chǎn)的 DNA/提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 | EPSPS 反應液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。
3. 加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；
4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25ul；熒光通道選擇： 檢測通道
（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；
可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。
6. 質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32；以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
7. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
? 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；
? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；
? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；
? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；
? 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
? 所有操作嚴格按照說明書進行；
? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，wan全混勻并短暫離心；
? 反應液應避光保存；
? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
? 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。.
【參考文獻】
[1] 中國農(nóng)業(yè)部. 1861 號公告-5-2012 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測 CP4-epsps 基因定性 PCR 方法[S]. 北京: 科學出版社, 2012.
[2] 韓強, 劉瑞芳, 陸玲鴻, 等. 實時熒光 PCR 檢測轉(zhuǎn)基因大豆外源基因的拷貝數(shù)[J]. 核農(nóng)學報, 2016 , 30 (4) :646-653.
[3] 岳巖磊. EPSPS 基因直接作為大豆遺傳轉(zhuǎn)化篩選標記的研究[J]. 哈爾濱師范大學, 2012.
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