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目錄:優利科(上海)生命科學有限公司>>科研試劑盒>>PCR試劑盒>> 熒光定量RT-PCR試劑盒(兩步法)

熒光定量RT-PCR試劑盒(兩步法)
  • 熒光定量RT-PCR試劑盒(兩步法)
參考價 面議
具體成交價以合同協議為準
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具體成交價以合同協議為準
  • 品牌 YLKBIO
  • 型號
  • 廠商性質 生產商
  • 產品資料 查看pdf文檔
  • 所在地 上海
屬性

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更新時間:2024-06-28 20:55:38瀏覽次數:1418評價

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純度 詳詢 供貨周期 現貨
規格 50T 貨號 YLK10356P
應用領域 化工,生物產業 主要用途 科研實驗
英文名稱 Two-Step?qRT-PCR?Kit 運輸方式 低溫運輸
保存條件 -20℃保存 有效期 12個月
熒光定量RT-PCR試劑盒(兩步法)是整合 cDNA 第一鏈合成試劑(RT 試劑盒)和即用型 qPCR 試劑而得的qRT-PCR 試劑盒。cDNA 第一鏈合成反應和 qPCR 反應分別在兩個離心管中進行。

中文名稱:熒光定量RT-PCR試劑盒(兩步法)

英文名稱:Two-Step qRT-PCR Kit


規格及成分

成 分

十孔盒包裝

2×RT Mix

40 uL(黃蓋

MMLV 逆轉錄酶 (含 RI)

10 uL(紅蓋

2×qPCR MagicMix

1 mL(棕色管

定量PCR 專用模板稀釋液

1 mL(綠蓋

RNase-free

1 mL(藍蓋

使用手冊

1 份

熒光定量RT-PCR試劑盒(兩步法)低溫運輸,-20℃保存, 有效期一年。

自備試劑

樣品 RNA、PCR 引物、ROX 染料


熒光定量 RT-PCR 試劑盒(兩步法) 特點:

1.    即開即用,足夠 50 次 RT 反應(10uL 體系)和 50 次 qPCR 反應(20 uL 體系)。

2.    RT 和 PCR 分開進行,方便優化 RT 和 qPCR 條件,也方便一個 RT 反應用于多個不同引物的 qPCR 擴增。

3.    RT mix 中含除酶、模板和引物以外的 RT 成分,簡化了反應設置步驟。

4.    qPCR mix 是 2×預配液,也簡化了反應設置步驟。

5.    qPCR mix 含 qPCR 染料,無需另外加入相關熒光 PCR 染料。

6.    擴增效率高, 最長可擴增 5 Kbp 以上的 RNA。

7.    提供定量 PCR 專用模板稀釋液,保證在制作標準曲線時低濃度樣品的準確性。


使用方法

一、樣品 RNA 的制備(本試劑盒不提供相關試劑)

1、可用自本公司各種 RNA 提取方法提取樣品的 RNA,也可以選用其他供應商的產品,但得到的 RNA 一定要溶解在RNase-free 的超純水中。

2、如果需要用 RNA 制備標準曲線,則需在此步用定量 PCR 專用模板稀釋液將 RNA 樣品稀釋不同梯度,并分別作為下步 RT 反應的模板。

3、由于污染的 gDNA 會嚴重影響 RNA 的定量,因必須che底去除 RNA 樣品中的gDNA 污染。用戶可以另購 RNase-free DNase 來消化 RNA 樣品,也可以合成只識別外顯子的引物。

二:RT(逆轉錄)反應合成 cDNA

4、按下表配制 RT 反應體系(10 uL 體系),在每個管中加入下列成分:


成分
加入量

總 RNA

100-500 ng

2×RT mix

4 uL

MMLV 逆轉錄酶

1 uL

RNase-free 水

補到 10 uL







5、42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應。

6、85℃保溫 5 秒以終止反應,然后放置在冰上待用。

7、合成的 cDNA 可以直接作為下步 qPCR 模板使用,不需要純化。剩余樣品可以放置在

-20℃長期保存。如果需要用 cDNA 制備標準曲線,則需在此步用定量 PCR 專用模板稀釋液將 cDNA 樣品稀釋不同梯度,并分別作為下步qPCR 反應的模板。

三、qPCR(20 uL 體系)

8、在每個 PCR 管中加入下列成分:

成分

加入量

qPCR MagicMix

10 uL

cDNA 樣品來于上步的 RT 反應

2 uL

PCR 正向引物(10 pmol/uL)

1 uL

PCR 反向引物(10 pmol/uL)

1 uL

自備 ROX 染料I II見注

2 uL

RNase-free

4 uL










注意:如果使用 ABI 公司的 7500,7700 和 7900 三種型號的熒光 PCR 儀器,則需用自備的 ROX 進行 Ct 值校正。對 ABI 7700 和 7900,ROX 的最佳濃度為 1×(即在每 20 uL 反應體系中加 2 uL 10×ROX)。對 ABI 7500, ROX 的最佳濃度為 0.05-0.1×(每 20 uL 反應體系加 0.1-0.2 uL 10×ROX;也可將 10×ROX 稀釋到

1×,然后每個反應體系加入 1-2 uL 1×ROX)。ROX 會在溶解曲線中產生噪音,因此,如果出現了雜峰,將軟件中“Passive Reference Dye"中的“ROX"選項取消打勾,然后重新分析數據。

對于iCycler IQ,MJ Opticon,MJ Chromo4,MX3000,MX4000, RotorGene3000, RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型號的熒光PCR 儀器,ROX 不是必須的但加入的話也不會影響整個 PCR 分析。

9、PCR 反應參數(需要用戶根據模板和引物決定,下面參數的只做參考):

過程

溫度

時間

預變性

94℃

5 min

PCR 反應

40 個循環)

94℃

1 min

55℃

1 min

72℃

2 min

最后延伸

72℃

10 min




10、 實驗結果分析:反應結束后確認擴增曲線和溶解曲線,制作標準曲線。具體方法

隨儀器不同而不同,請參考 qPCR 儀器手冊。

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