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目錄:優利科(上海)生命科學有限公司>>科研試劑盒>>PCR試劑盒>> 免RNA提取RT-PCR試劑盒

免RNA提取RT-PCR試劑盒
  • 免RNA提取RT-PCR試劑盒
參考價 面議
具體成交價以合同協議為準
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  • 品牌 YLKBIO
  • 型號
  • 廠商性質 生產商
  • 產品資料 查看pdf文檔
  • 所在地 上海
屬性

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更新時間:2024-06-28 20:57:58瀏覽次數:1001評價

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純度 詳詢 供貨周期 現貨
規格 50T 貨號 YLK10357P
應用領域 化工,生物產業 主要用途 科研
中文名稱: 免RNA提取RT-PCR試劑盒 英文名稱: Cell?Lysate?RT-PCR?Kit
運輸: 低溫運輸 保存條件: -20℃
有效期: 24個月 自備試劑 RT 引物、PCR 引物對
免RNA提取RT-PCR試劑盒是一種免 RNA 提取的 RT-PCR 試劑盒,它使用精心優化的細胞裂解液直接裂解培養細胞,然后直接在細胞裂解液中進行 RT,再用 cDNA 進行 PCR 或熒光定量 PCR。

中文名稱:免RNA提取RT-PCR試劑盒

英文名稱:Cell Lysate RT-PCR Kit

運輸及保存

低溫運輸,-20℃保存,有效期兩年

自備試劑

RT 引物、PCR 引物對

規格及成分

成 分

十孔盒包裝

溶液 A

25 mL

溶液 B

   0.5 mL

MMLV 逆轉錄酶 (含 RI)

100 µL

RT Buffer(含 dNTP)

300 µL

PCR MagicMix 3.0(含染料)

9 mL

RNase-free 水

10 mL

使用手冊

1 份

使用方法


注意:無 RNase 的環境和使用無 RNase 污染的試劑是本實驗成功的關鍵。

強烈建議使用優利科的固相 RNase 清除劑去除工作臺面的 RNase,用氣相

RNase 去除空氣中的 RNase。實驗前需要將 95%乙醇放-70℃預冷,最好用空槍頭盒盛乙醇。

一、細胞培養、裂解

1.     按常規方法培養細胞、胰/酶消化并計數。

2.     轉移 1×10E5 個細胞到離心管中,400×g 離心 4 分鐘。

3.     吸棄上清(即培養基),保留細胞沉淀。

4.     用 0.5 mL 溶液 A 重懸細胞,并將細胞濃度調整到 2×10E5 細胞/mL。

5.     轉移 10 µL 的懸浮細胞到 0.2 mL PCR 管中,并加入 10 µL 的溶液 B,此時細胞終濃度為 10E5 細胞/mL。

6.     迅速將離心管插入浮子中,放入-70℃預冷的、95%乙醇中 1-3 分鐘。10 µL 槍頭盒一般能讓 0.2 mL 的 PCR 管一半沒入到乙醇中。

7.     在室溫的水浴鍋中快速解凍細胞,渦旋 10 秒后短暫離心數秒,將管中液體

(細胞裂解液)轉移到新的離心管中,放冰上待用。

二、RT(逆轉錄)反應合成 cDNA

8.     按下表設置 RT 反應體系20 µL 體系為例):

成分

樣品管

陰性對照管

細胞裂解液(含 RNA)

2.5 µL

2.5 µL

RT Buffer(含 dNTP

6 µL

6 µL

MMLV 逆轉錄酶(含 RI)

2 µL

RT 引物(100ng/µL)

1 µL

1 µL

RNase-free 水

補水到 20 µL

補水到 20 µL









9 .     2℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應。

10.     70保溫 10 分鐘以終止反應,然后放冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作PCR 模板使用,不需要純化。也可以放置在-20℃長期保存

三、PCR 方案一(RT 產物全部用于 PCR)

11.     在上步的 RT 反應管中直接按下表加入各成分(100 µL 體系為例):

成分

每管加入量

PCR MagicMix 3.0(已加染料

50 µL

自備正向 PCR 引物 (100 ng/µL)

2 µL

RNase-free 水

補水到 100 µL





  12.    直接進入第 14 步。

四、PCR 方案二(部分 RT 產物用于 PCR

13.    按下表設置 PCR 反應體系(以 30 µL 體系為例):

成分

每管加入量

PCR MagicMix 3.0(已加染料

15 µL

cDNA 樣品(RT 反應產物)

1-5 µL

自備正向 PCR 引物 (100 ng/µL)

1 µL

自備反向 PCR 引物 (100 ng/µL)

1 µL

RNase-free 水

補水到 30 µL

注意:RT 引物可以用做反向 PCR 引物。

14.    PCR 反應參數(需要根據模板和引物 Tm 值決定,下面的參數只做參考):

過程

溫度

時間

預變性

94℃

5 min

PCR 反應

(35 個循環)

94℃

1 min

55℃

1 min

72℃

2 min

最后延伸

72℃

10 min

五、電泳檢測

15.    取 5-10 µL PCR 產物直接在瓊脂糖凝膠上電泳,跟分子量標準比較估計出擴增產物的大小。注:本試劑盒中的 PCR mix 含有甘油和染料,可以直接上樣,不需要額外再加電泳上樣液。


免RNA提取RT-PCR試劑盒

特點如下:

1.     免 RNA 提取,從細胞裂解到 RT-PCR 或實時定量 RT-PCR 結果只需三個步驟,省略了整個 RNA 提取過程。

2.     靈敏度不低于常規方法(先提總 RNA 再進行 RT-PCR),不但可以檢測到低拷貝的 RNA,還可用于檢測 miRNA。

3.     整合了去除基因組 DNA 的步驟,只檢測 RNA,無需擔心基因組 DNA 的污染。

4.     每次只需要 10-100000 個培養細胞或含相應細胞數的痕量組織(如 LCM 樣品),驗證過的細胞包括 Hela、CHO、293、COS-7 等,但不能用于 U937 細胞系。

5.     兩步法 RT-PCR,后續使用靈活。得到的 cDNA 既可用于普通 PCR,也可用于基于 SYBR 的熒光定量 PCR,也可用于其他定量 PCR(如 TaqMan), 非常靈活。

6.     即適用于少量樣品,也適用于平行處理大量樣品及高通量篩查。

7.     本產品足夠用于 50 次 20µL 體系的 RT 和 600 次 30µL 體系(或約 200 次100µL 體系)的 PCR。

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