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| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | YLK10360P | 應用領域 | 化工,生物產業 |
| 主要用途 | 科研實驗 | 英文名稱 | Two-Tube RT-PCR Kit |
| 運輸： | 低溫運輸 | 保存條件： | -20℃ |
| 有效期： | 12個月 | 自備試劑 | 樣品 RNA、模板專一正向和反向引物 |
兩管式RT-PCR試劑盒（MMLV-Taq）說明書
中文名稱：兩管式RT-PCR試劑盒（MMLV-Taq）
英文名稱：Two-Tube RT-PCR Kit（AMV-Taq）
本試劑盒是整合 cDNA 第一鏈合成試劑和即用型 PCR 試劑而得的 RT-PCR 試劑盒。cDNA 第一鏈合成反應和PCR 反應分別在兩個離心管中進行。
規格及成分：
成分 | 50次塑料袋包裝 |
RT試劑盒 | 50 次 |
即用型PCR試劑盒 | 9 ml |
使用手冊 | 1 份 |
RT試劑盒成分表：
RT試劑盒成分 | 50次包裝 |
MMLV逆轉錄酶（含RT) | 100 ul |
RTBuffer （含dNTP) | 300 ul |
Oligo（dT)18引物（0.5ug/ul） | 50 ul |
隨機引物（0.2ug/ul） | 50 ul |
RNase-free 水 | 10 ml |
即用型 PCR 試劑盒成分表：
即用型PCR 試劑盒 3.0 成分 | 600 次包裝 |
PCR MagicMix 3.0 | 9 mL |
專用染料 | 360 uL |
兩管式RT-PCR試劑盒（MMLV-Taq）具有以下特點：
1.即開即用，足夠 50 次 RT 反應（20 uL 體系）和 600 次PCR 反應（30 uL 體系）。
2.cDNA 第一鏈合成試劑盒可靈活選用隨機引物、Oligo dT 引物或基因專一引物，適合各種情況。
3.PCR 試劑盒具有即用、簡單等優點，PCR mix 中含上樣染料，所以 PCR 產物可以直接上樣電泳。
4. 兩管式操作，RT 和PCR 在不同試管中進行，便于單獨優化 RT 反應或PCR 反應條件。
5.擴增效率高, 最長可擴增 5 Kbp 以上的 RNA。
運輸及保存
低溫運輸,-20℃保存, 有效期一年。
自備試劑
樣品 RNA、模板專一正向和反向引物。
使用方法：
一、樣品 RNA 的制備（本試劑盒不提供相關試劑）
可用自本公司各種 RNA 提取方法提取樣品的 RNA，也可以選用其他供應商的產品，但得到的 RNA 一定要溶解在RNase-free 的超純水中。
二：RT（逆轉錄）反應合成 cDNA
1.按下表配制 RT 反應體系（20 uL 體系）:
RNA 模板 | |
總 RNA | 100-500 ng |
或 poly(A) mRNA | 10-500 ng |
或專一的 RNA（如體外轉錄制備的） | 0.01 pg-500 ng |
引物 | |
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) | 1 uL |
或隨機引物(0.2 ug/uL) | 1 uL |
或自備模板專一反向引物(10 pmol/uL) | 1-2 uL |
RNase-free 水 | 補水到 12 uL |
注意：RNA 樣品不能含有基因組 DNA 污染。隨機引物與 RNA 模板的比例將決定cDNA 合成的平均長度（成反比）。一般情況下隨機引物效率好于 OligodT 引物，但如果只想轉錄總 RNA 中的 mRNA（只占 5%左右），則可優先選用 OligodT 引物，這樣就可以排除非mRNA 的干擾。
2.70℃保溫 5 分鐘變性模板后立即冰浴。
3.按順序加入 6 uL RT Buffer（含 dNTP）和 2 uLMMLV 逆轉錄酶（含 RI），反應終體積為 20 uL。
4.42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應。
5.70℃保溫 10 分鐘以終止反應，然后放置在冰上待用。
6.合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，不需要純化。剩余樣品可以放置在-20℃長期保存。
三、PCR（30 uL 體系）
1、將全部專用染料加入到PCR MagicMix 3.0 中，輕柔顛倒混勻即可使用。未用完的部分需要在-20℃。也可以不加專用染料，但在 PCR 結束后，電泳上樣前，則需要加入電泳上樣液，否則電泳時沒法判斷電泳速度。
2、在 PCR 管中加入下列成分：
成分 | 加入量 |
PCR MagicMix 3.0（已加染料） | 15 uL |
cDNA 樣品（上步的 RT 反應液） | 1-5 uL |
模板專一性正向引物(10 pmol/uL) | 1-2 uL |
模板專一性反向引物(10 pmol/uL) | 1-2 uL |
補水到 | 30 uL |
注意：cDNA 也可以稀釋后用作 PCR 模板。是否稀釋或稀釋多少倍wan全取決于靶基因的豐度。
PCR 反應參數(需要根據模板和引物決定，下面的只做參考)：
過程 | 溫度 | 時間 |
預變性 | 94℃ | 5min |
PCR反應 （35個循環） | 94℃ | 1min |
55℃ | 1min | |
72℃ | 2min | |
最后延伸 | 72℃ | 10min |
四、電泳檢測
1、取 5-0 uL PCR 產物直接在PAGE 或瓊脂糖凝膠上電泳，跟分子量標準比較估計出擴增產物的大小。注：本試劑盒中的PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上樣，不需要
額外再加電泳上樣液。
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