目錄:優利科(上海)生命科學有限公司>>科研試劑盒>>PCR試劑盒>> 腸道病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒
供貨周期 | 現貨 | 規格 | 50T |
---|---|---|---|
貨號 | YLK10375P | 應用領域 | 化工,生物產業 |
主要用途 | 科研實驗 | 英文名稱 | Enterovirus(EV) SYBR qRT-PCR Kit |
保存條件 | 低溫運輸,-20℃保存 | 有效期 | 12個月 |
試劑盒說明 | 不同批號的試劑盒組分不可交互使用 |
腸道病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒
商品名稱:腸道病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒
Name :Enterovirus(EV) SYBR qRT-PCR Kit
腸道病毒(Enterovirus,EV)是一種RNA病毒,會引起甲型肝炎,甲型肝炎的潛伏期為15~45天,甲肝病毒散發時以小兒為最多,常表現為食欲減退,厭油,消化不良等。一旦甲肝出現黃疸,出發癥狀開始明顯減輕,胃納好轉,肝大有腫痛,部分病例有脾大,血清膽/紅素在病后1-2周內為最高,黃疸可持續2-6周,約1個月左右即消退,因此腸道病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。本產品基于PCR原理開發。它具有下列特點:
1.一站式,用于不需要單獨準備每種成分,包括引物和對照。
2.根據腸道病毒的保守基因序列設計的引物,具有良好的特異性。
3. 基于染料法qRT-PCR檢測,靈敏度比常規RT-PCR高10-100倍,可以達到至少1000拷貝/反應。
4.使用一管式qRT-PCR技術,RT和PCR兩步在一個試管內完成,不需要中間轉移樣品,降低了操作誤差和可能的污染。
5.本產品足夠50次30μL體系的RT-PCR,只能用于科研,不能用于臨床。
【試劑組成】
成 份 | 十孔盒包裝 |
2×qRT-PCR 緩沖液 | 500 μL(棕色管) |
10×qRT-PCR酶混合液 | 100 μL(紅蓋) |
ROX染料I | 50 μL(棕色管) |
ROX染料II | 50 μL(棕色管) |
熒光PCR專用模板稀釋液 | 1mL(亮黃蓋) |
腸道病毒RT-PCR引物混合液 | 100 μL(白蓋) |
腸道病毒RT-PCR陽性對照 (1×10E8拷貝/μL) | 50 μL(黃蓋) |
核酸釋放劑試用裝 | 20次(1mL,綠蓋) |
使用手冊 | 1份 |
【儲存條件及有效期】
低溫運輸,-20℃保存,保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供RNA片段作為陽性對照。
【自備試劑】樣品RNA
【使用方法】
一、稀釋陽性對照(以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原。
1. 標記6個離心管,分別為7,6,5,4,3,2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
2. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
3. 換槍頭,在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
4. 換槍頭,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品RNA的制備
5. 如果有N個樣品,必須設置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)。可以用10μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號(濃度為1×10E4拷貝/μL,10μL相當于1萬拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽性對照(加水后其總體積跟樣品一樣,樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)。可以用水作為制備的陰性對照。
6. 用自選方法純化N+2個樣品的RNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒RNA提取試劑盒兼容。
三、設置RT-PCR反應(20μL體系,在樣品制備室進行)
7. 如果做定量分析并且只做1次重復,則標記N+9個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照,6個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做1次重復,則標記N+4個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照(用水做模板),1個用于PCR陽性對照(用第4號陽性對照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟,定性分析只是把6個標曲反應縮減成1個,其余不變。
8. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加):
成分 | N+2個制備所得樣品 | RT-PCR陰性對照 | RT-PCR陽性 對照(2-7管) |
2×qRT-PCR 緩沖液 | 10μL | 10μL | 各10μL |
口蹄疫病毒RT-PCR 引物混合物 | 2μL | 2μL | 各2μL |
50×ROX (見注) | 0.4μL | 0.4μL | 各0.4μL |
樣品制備所得RNA模板(來于第8步) | 5.6μL | 不加 | 不加 |
稀釋所得6個陽性對照(來于第6步) | 不加 | 不加 | 各5.6μL(2號樣到2號管,3號樣到3號管…) |
10×qRT-PCR 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
注:需使用ROX染料I的機型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用ROX染料II的機型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX的機型:Thermal Cycle Dice Real Time System, LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。
9. 上機后按下面參數進行RT-PCR(參數可能會因儀器不同而需優化)。
過程 | 溫度 | 時間 |
RT(逆轉錄) | 50℃ | 15-30分鐘 |
預變性 | 94℃ | 2分鐘 |
RT - PCR反應 (30個循環) | 95℃ | 15 秒 |
60℃ | 15 秒(采集FAM通道的熒光信號) | |
72℃ | 15 秒 | |
按儀器預設程序進行溶解曲線分析 |
四、數據處理
10. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值,再推算出其濃度。
11. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct值應該小于或等于30。對待測樣品,如果其Ct大于或等于40則為陰性,如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。