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| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | YLK10380P | 應用領域 | 化工,生物產業 |
| 主要用途 | 科研實驗 | 英文名稱 | Clostridium Difficile Probe PCR Kit |
| 保存條件 | 低溫運輸，-20℃保存 | 有效期 | 12個月 |
| 試劑盒說明 | 不同批號的試劑盒組分不可交互使用 |
艱難梭狀芽孢桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒
商品名稱：艱難梭狀芽孢桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒
Name ：Clostridium Difficile Probe PCR Kit
艱難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)屬厭氧性細菌，一般寄生在人的腸道內。如果過度服用某些抗生素，艱難梭菌的菌群生長速度加快，影響腸道中其他細菌，引發炎癥。該細菌會引起偽膜性腸炎，臨床表現為腹瀉、腹痛、伴有全身中毒癥狀，癥狀突然開始，并伴隨血壓低，嚴重時能致死。通常還伴有發燒，白細胞增多，之后可導致死亡，是很嚴重的一類疾病。該細菌還會引起抗生素相關性腹瀉，在體內的潛伏期為5-10天，之后導致大量的棕色或水狀腹瀉，持續1周左右。除上述疾病外，艱難梭菌尚可引起腎盂腎炎、腦膜炎、腹腔及陰道感染、菌血癥和氣性壞疽等。近年來該菌已成為醫院內感染的病原菌之一，日益被人們所重視，因此快速檢測艱難梭狀芽孢桿菌具有重要意義。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術，本產品就是以染料法熒光定量PCR技術為基礎開發的專門檢測艱難梭狀芽孢桿菌的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據人艱難梭狀芽孢桿菌高度保守的VP1區設計，不會跟其他微生物的DNA發生交叉反應。
5. 本產品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應。
6. 本產品只能用于科研。
【試劑組成】
成分 | 十孔盒包裝 |
2×Probe qPCR MagicMix | 0.5 mL（本色蓋） |
熒光PCR專用模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
艱難梭狀芽孢桿菌PCR引物 | 100 μL（白蓋） |
艱難梭狀芽孢桿菌qPCR探針 | 100 μL（棕色管） |
艱難梭狀芽孢桿菌陽性對照2.0 (1×10E8拷貝/μL) | 50 μL（紅蓋） |
DNA釋放劑試用裝 | 50次（試用裝） |
使用手冊 | 1份 |
【儲存條件及有效期】
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】樣品 DNA。
【使用方法】
一、稀釋標準曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
7. 如果有N個樣品，最好設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數細菌DNA/提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）
9. 如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線樣品。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
成分 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照管 | 標準曲線 樣品管（2-7管） |
2×Probe qPCR MagicMix（本色蓋） | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
艱難梭狀芽孢桿菌 qPCR探針（綠蓋） | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
艱難梭狀芽孢桿菌 PCR引物混合液（白蓋） | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
待測樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
第7步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7號） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…） |
11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR：
過程 | 溫度 | 時間 |
預變性 | 94℃ | 5 min |
PCR反應 （40個循環） | 94℃ | 0.5 min |
50℃ | 0.5 min（采集FAM通道的熒光信號） | |
72℃ | 0.5 min | |
最后延伸 | 72℃ | 10 min |
五、數據處理
12. 以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
六、電泳檢測
13. 如果有必要電泳確認，可取10-20μL PCR產物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產物的大小為400 bp。但電泳非常容易污染實驗環境，建議不輕易采納。
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