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目錄:優(yōu)利科(上海)生命科學有限公司>>科研試劑盒>>PCR試劑盒>> 柯薩奇病毒A10型PCR檢測試劑盒

柯薩奇病毒A10型PCR檢測試劑盒
  • 柯薩奇病毒A10型PCR檢測試劑盒
參考價 面議
具體成交價以合同協(xié)議為準
參考價 面議
具體成交價以合同協(xié)議為準
  • 品牌 YLKBIO
  • 型號
  • 廠商性質(zhì) 生產(chǎn)商
  • 所在地 上海市
屬性

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更新時間:2024-07-18 07:26:49瀏覽次數(shù):337評價

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供貨周期 現(xiàn)貨 規(guī)格 48T
貨號 YLK10387P 應(yīng)用領(lǐng)域 化工,生物產(chǎn)業(yè)
主要用途 科研實驗 保存條件 -20±5℃
有效期 9個月 試劑盒說明 不同批號的試劑盒組分不可交互使用
柯薩奇病毒A10型PCR檢測試劑盒用于體外定性檢測人咽/拭子樣本中的柯薩奇病毒 A10 型核糖核酸(RNA)。

柯薩奇病毒A10型PCR檢測試劑盒


產(chǎn)品名稱:柯薩奇病毒A10型PCR檢測試劑盒

本試劑盒用于體外定性檢測人咽/拭子樣本中的柯薩奇病毒 A10 型核糖核酸(RNA)。

柯薩奇病毒 A10 型(Coxsackievirus A10,CA10) 為單股正鏈RNA 病毒,屬于人類腸道病毒 A 類。CA10 為人類感染性疾病的一種病原,能引起多種疾病,如手足口病、皰疹性咽峽炎和脫甲病等。近幾年爆發(fā)的手足口病中除了主要病原體 EV71 外,還有多種人類腸道病毒參與感染,CA10 為其常見的一種。本試劑盒采用實時熒光 RT-PCR 方法,對咽/拭子樣本中的 CA10 核酸進行定性檢測, 檢測結(jié)果僅供科研,不能單獨作為確診或排除病例的依據(jù)。

本試劑盒利用實時熒光 PCR 技術(shù),以 CA10 基因組編碼區(qū)的高度保守區(qū)為靶區(qū)域,設(shè)計特異性引物及熒光探針,通過一步法RT-PCR 擴增對 CA10 RNA 進行定性檢測。另外,本試劑盒帶有內(nèi)標物質(zhì),用于對核酸提取過程及 PCR 擴增過程的監(jiān)控,可減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。


【試劑組成】

組分名稱

規(guī)格

數(shù)量

主要成分

 

PCR 檢測試劑

(48人份/盒)

CA10 PCR 反應(yīng)液 A

816µL/管

1

特異性引物和探針、三羥甲基氨基甲烷-

鹽酸緩沖液等

CA10 PCR 反應(yīng)液 B

144µL/管

1

熱啟動 Taq 酶、c-MMLV 酶

CA10 內(nèi)標溶液

240µL/管

1

含內(nèi)標片段的假病毒

質(zhì)控品

陰性質(zhì)控品

200µL/管

1

生理鹽水

CA10 陽性質(zhì)控品

200µL/管

1

含 CA10 目的片段的假病毒












注:不同批號試劑盒的以上成分不可以互換使用; 需自備的試劑:核酸提取/試劑。

陰陽性質(zhì)控品說明:陽性質(zhì)控品為含 CA10 目的序列的假病毒溶液,濃度為 1×105copies/mL;陰性質(zhì)控品為生理鹽水。陰陽性質(zhì)控品在實驗中均參與核酸提取。


【儲存條件及有效期】

試劑盒保存于-20±5℃,有效期 9 個月;

反復凍融次數(shù)不超過 7 次;試劑開瓶后,在 4℃儲存溫度條件下開瓶次數(shù)不超過 7 次;試劑在 4℃條件下連續(xù)保存不超過 14 天;試劑在 37℃條件下連續(xù)保存不超過 120h;運輸采用干冰保持低溫,運輸時間不應(yīng)超過 3 天。

試劑盒生產(chǎn)日期及失效期見產(chǎn)品標簽。


【適用儀器】

ABI Prism 7300,ABI Prism 7500,Roche LightCycler480,DA7600。


【樣本要求】

1.  適用樣本類型:咽/拭子。

2.  樣本采集:

樣本采集對象為手足口病、皰疹性咽峽炎等患者或疑似患者,特別是發(fā)病所在地的社區(qū)或托幼機構(gòu)的 5 歲以下的兒童。

采集病人發(fā)病 3 日內(nèi)的咽/拭子樣本,用專用采樣棉簽,適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位,應(yīng)避免觸及舌部;迅速將棉簽放入裝有 3~5ml 保存液(維持液或生理鹽水,推薦使用維持液)的采樣管中,在靠近頂端處折斷棉簽桿,旋緊管蓋并密封,以防干燥。臨床樣本在運輸和貯存過程中要避免反復凍融,如果不能確保-20℃的條件,應(yīng)該在 0~8℃運輸和保存。樣本應(yīng)冷凍運輸, 運輸時要附有必要的信息,如樣本編號、發(fā)病日期和樣本采集日期。

3.  樣本保存和運送:樣本可立即用于測試,也可保存于-20℃待測,保存期為 4 個月;長期保存,請置于-70℃。運送采用 0℃冰壺。


【使用方法】

1.  樣本處理和核酸提取(樣本處理區(qū))

可采用本公司生產(chǎn)的核酸提取/或純化試劑(如離心柱法;磁珠法)。本試劑盒中的內(nèi)標溶液參與提取過程,若提取試劑盒中無說明內(nèi)標的使用方法,則可按照樣本體積:內(nèi)標溶液體積=50:1 的比例在樣本中加入內(nèi)標溶液后進行核酸提取。

本試劑盒中的陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品均需要提取,用于對環(huán)境進行監(jiān)控和 PCR 檢測試劑的質(zhì)控。

 

2.  PCR 試劑準備(試劑準備區(qū))

2.1       大包裝規(guī)格試劑使用:

從試劑盒中取出 CA10 PCR 反應(yīng)液 A、CA10 PCR 反應(yīng)液 B,室溫融化后振蕩混勻,8,000rpm 離心數(shù)秒后使用。取 N 個(N=待測樣本個數(shù)+陰性質(zhì)控品+ CA10 陽性質(zhì)控品)PCR 反應(yīng)管,

CA10 單人份擴增體系配制如下表:

 

CA10 PCR 反應(yīng)液   A

CA10 PCR 反應(yīng)液   B

擴增體系

17µL

3µL

20µL

將各組分充分混合后進行短時離心,以使管壁上的液體全部離心至管底,之后將 20µL 擴增體系分裝到PCR 管中。

2.2        單管單人份規(guī)格試劑使用: 直接使用 CA10 PCR 反應(yīng)管。

 

3.  加樣(樣本制備區(qū))

往上述對應(yīng)的CA10 反應(yīng)管中分別加入提取后的待測樣本核酸、陰性質(zhì)控品核酸、陽性質(zhì)控品核酸各 5µL,蓋緊管蓋,8,000rpm 離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移至擴增檢測區(qū)。

 

4.  PCR 擴增(擴增檢測區(qū))

4.1        將反應(yīng)管放入儀器樣品槽內(nèi)。

4.2      ABI Prism 7500 儀器設(shè)置(ABI Prism 7300 儀器設(shè)置參照此操作)

4.2.1 打開“Setup"窗口,按樣本對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控(NTC)、陽性質(zhì)控以及未知樣本(Unknow),并在“Sample Name"一欄中設(shè)置樣本名稱;探針檢測模式設(shè)置為:Reporter Dye1:FAM,Quencher Dye1:NONE,Reporter Dye2:VIC ,Quencher Dye2:NONE, Passive Reference: NONE。

4.2.2  打開instrument窗口,設(shè)置循環(huán)條件如下: 50℃ 15分鐘,1個循環(huán);

95℃ 15分鐘,1個循環(huán);

94℃ 15秒→60℃ 45秒(收集熒光),45個循環(huán)。設(shè)置完成后,保存文件,運行程序。

4.3     LightCycler480儀器設(shè)置

4.3.1  打開軟件后,選擇“New Experiment",設(shè)置檢測模式為“Multi Color Hydrolysis Probe/UPL Probe",檢測通道為FAM, VIC。

4.3.2  設(shè)置循環(huán)條件:

Program name

Cycles

Target(℃)

Running Time

Analysis Mode

Acquisition Mode

1

1

50

00:15:00

None

None

2

1

95

00:15:00

None

None

3

45

94

00:00:15

None

None

60

00:00:45

Quantification

Single

4

1

40

00:00:20

None

None







4.3.3  選擇“Sample Editor",設(shè)定樣品的名稱、類型,在“Standard Concentration"框中輸入標準品濃度,設(shè)置完成后,保存文件,運行程序。

4.4      DA7600 儀器設(shè)置

4.4.1 打開軟件后,在設(shè)置程序參數(shù)界面中,設(shè)置擴增程序和溫度設(shè)置,條件如下:

編號

程序名

循環(huán)

目標溫度

恒溫時間

讀取熒光

1

1

1

50

00:15:00


2

2

1

95

00:15:00


3

3

45

94

00:00:15


60

00:00:45

4

4

1

40

00:00:20









4.4.2  點擊樣本參數(shù)界面,按樣本對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控(NTC)、陽性質(zhì)控以及未知樣本(UNK),并在“樣本名稱"一欄中設(shè)置樣本名稱;探針染料類型選擇:FAM 和HEX 。

4.4.3 設(shè)置完成后,保存文件,運行程序。

 

5.  結(jié)果分析(請參照各儀器使用說明書進行設(shè)置,以 ABI7500 儀器為例)

反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據(jù)實際情況自行


 

調(diào)整,Start 值可以在 3~15、End 值可設(shè)在 5~20,在 Log 圖譜窗口設(shè)置 Threshold 的 Value 值,使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期, 陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線),點擊 Analysis 自動獲得分析結(jié)果,在此基礎(chǔ)上,微調(diào)閾值線位置使所得標準曲線的R2 值最大即可在“Report"窗口讀取檢測結(jié)果。

 

6.  質(zhì)量控制

6.1       陰性質(zhì)控品:FAM 檢測通道無擴增曲線,VIC 檢測通道有擴增曲線且 Ct 值<43。

6.2   陽性質(zhì)控品:FAM 檢測通道有擴增曲線,且 Ct 值<33;VIC 檢測通道有或無擴增曲線。以上要求需在同一次實驗中同時滿足,否則,本次實驗無效,需重新進行。

 

7.  結(jié)果判斷

7.1        內(nèi)標結(jié)果判定:若樣品 VIC 通道 Ct<43,則可判定該樣品內(nèi)標陽性,若 VIC 通道無擴增曲線或 Ct≥43,則可判定該樣品內(nèi)標陰性。

7.2        若檢測樣品 FAM 檢測通道無擴增曲線或 Ct≥43,且該樣品內(nèi)標陽性,可判樣品為柯薩奇病毒 A10 型陰性,

7.3       若檢測樣品 FAM 檢測通道有擴增曲線且 Ct≤38,可判樣品為柯薩奇病毒 A10 型陽性,

7.4       若檢測樣品 FAM 檢測通道有擴增曲線且 38<Ct<43,該樣品建議復檢,若復檢結(jié)果 Ct<43 則可判樣品為柯薩奇病毒 A10 型陽性;若復檢結(jié)果無擴增曲線或 Ct≥43,可判樣品為柯薩奇病毒 A10 型陰性。

 

【陽性判斷值或者參考區(qū)間】

通過臨床樣本檢測結(jié)果分析,利用 ROC 曲線法最終確定本試劑盒的參考區(qū)間為 38~43;內(nèi)標參考值為 43。

 

【檢驗結(jié)果的解釋】

1. FAM 檢測通道為陽性時,由于體系的競爭關(guān)系,內(nèi)標可能為陰性。

2. 內(nèi)標結(jié)果為陰性時,若該檢測管的 FAM 檢測通道也為陰性,說明體系受抑制或操作失誤,試驗無效,需對該樣品進行復檢。

3. 每次實驗均需檢測陰性質(zhì)控品及陽性質(zhì)控品結(jié)果滿足質(zhì)量控制要求時方可進行檢測結(jié)果的判定;

 

【檢測方法的局限性】

1. 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送及保存質(zhì)量有關(guān);

2. 樣本處理時沒有控制好交叉污染,可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果;

3. 病毒在流行過程中的基因突變則也可能導致假陰性結(jié)果;

4. 由于不同提取方法的原理不同,采用不同核酸提取/試劑進行樣本處理時的核酸提取效率存在一定差異,請使用本產(chǎn)品說明書中檢驗方法所選用的核酸提取/試劑;

5. 本檢測結(jié)果僅供臨床參考,如需確診病例請結(jié)合臨床癥狀及其他檢測手段。

 

【產(chǎn)品性能指標】

1  試劑盒分析性能評估結(jié)果顯示:

1.1        陰陽性參考品符合率:5 份陽性參考品符合率為 100%;10 份陰性參考品符合率為 100%。

1.2        Z低檢測限:8.0×102copies/ml。

1.3        精密度:批內(nèi)、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數(shù)(CV)均小于 5%。

1.4        分析特異性

1.4.1                     交叉反應(yīng):交叉反應(yīng)驗證的柯薩奇病毒 A6 型、柯薩奇病毒 B 組、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腸道病毒 70 型、腸道病毒 71 型、柯薩奇病毒 A24v、埃可病毒 11 型、埃可病毒 30 型、麻疹病毒、風疹病毒、副流感病毒、腺病毒、腮腺炎病毒、鏈球菌、葡萄球菌、肺炎鏈球菌均為來源于臨床的滅活病毒培養(yǎng)物或者細菌培養(yǎng)液,并經(jīng) PCR 或測序確認為相應(yīng)病原體,在本試劑盒的檢測條件下,病原體濃度不高于 1.0×105copies/mL 時,檢測結(jié)果均為陰性,無交叉反應(yīng)。

1.4.2                     干擾反應(yīng):咽/拭子樣本可能存在的內(nèi)源性物質(zhì)以及可能存在的外源性藥物紅霉/素(60mg/L)、頭孢/克洛(75mg/L)、地塞/米松(0.6mg/L)、利巴/韋林(2mg/L)、干擾素(100 單位/ml)均不影響試劑盒的檢測結(jié)果。

2  臨床試驗:與對照方法檢測結(jié)果對比,本試劑盒檢測結(jié)果的靈敏度為 100%、特異度為 98.0%、總符合率 98.4%,Kappa 值為 0.952

(p<0.001)。

 

【注意事項】

1.  本產(chǎn)品僅用于體外檢測,實驗前請仔細閱讀本說明書;

2.為了避免樣本中任何潛在的生物危險,檢測樣本應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì),避免接觸到皮膚和粘膜;樣本的處理應(yīng)在可防止氣霧外流的生物安全柜中操作,樣本制備區(qū)所用過的試管、吸頭需打入盛有消毒劑的容器,并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄;樣本操作和處理均需符合相關(guān)法規(guī)要求:包括衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》和《醫(yī)療廢物管理條例》;

3.  產(chǎn)物處理:PCR 結(jié)束之后,產(chǎn)物容易引起污染,應(yīng)由當天不再參與實驗的人員將所有反應(yīng)管放入生物安全垃圾處理袋或其他容器中確認WAN全封閉后方可丟棄;

4.  全程應(yīng)避免RNA 酶污染,實驗過程中穿工作服,佩戴一次性手套和口罩。在潔凈消毒、紫外光殺菌的化學通風櫥或生物安全柜完成操作,避免有害物質(zhì)進入呼吸道;

5.  使用經(jīng)高壓滅菌的一次性離心管和吸頭或購買無DNA 酶、RNA 酶的離心管和吸頭;

6.  PCR 檢測試劑使用前要WAN全解凍,8,000rpm 離心數(shù)秒后使用,但應(yīng)避免反復凍融;

7.  如果在樣本處理中沒有控制好交叉污染,可能出現(xiàn)假陽性;

實驗室管理應(yīng)嚴格按照PCR 基因擴增實驗室的管理規(guī)范,實驗人員必須進行專業(yè)培訓,實驗過程嚴格分區(qū)進行(試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴增檢測區(qū)),所用消耗品應(yīng)滅菌后一次性使用,實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設(shè)備,各區(qū)各階段用品不能交叉使用;

1.  實驗完畢用 10%次氯酸或 75%酒精處理工作臺和移液器,然后用紫外線燈照射 20-30 分鐘; 10.完成樣本核酸提取后,建議馬上進行下一步實驗,否則請保存于-20℃待用(24h 內(nèi));

11. 所用消耗品應(yīng)滅菌后一次性使用,實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設(shè)備,各區(qū)各階段用品不能交叉使用;

12. 須對每次實驗進行質(zhì)量控制。


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