目錄:優利科(上海)生命科學有限公司>>科研試劑盒>>PCR試劑盒>> 人類白細胞抗原A基因染料法PCR試劑盒
供貨周期 | 現貨 | 規格 | 50T |
---|---|---|---|
貨號 | YLK10396P | 應用領域 | 化工,生物產業 |
主要用途 | 科研實驗 | 保存條件 | 低溫運輸,-20℃保存 |
有效期 | 12個月 | 試劑盒說明 | 不同批號的試劑盒組分不可交互使用 |
人類白細胞抗原A基因染料法PCR試劑盒
產品名稱:人類白細胞抗原A基因染料法PCR試劑盒
英文名稱:Human Leukocyte Antigen-A(HLA-A)SYBR qPCR Kit
人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)是人類的主要組織相容性復合體(MHC)的表達產物,該系統是目前所知人體最復雜的多態系統。 根據基因產物的結構,功能,細胞分布等因素,將 HLA 基因分成了 3 大類,其中 HLA-I 型基因,包括了 HLA-A,HLA-B,HLA-C 等經典的抗原基因。本產品就是以熒光定量 PCR 技術為基礎開發的專門檢測 HLA-A 基因的試劑盒,它具有下列特點:
1. 即開即用,用戶只需要提供 DNA 模板。
2. 特異性高,引物是根據 HLA-A 基因高度保守區設計,不會擴增其他基因。
3. 引物和擴增體系經過優化,靈敏性比常規 PCR 高 100 倍。
4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對照,便于區分假陰性樣品。
5. 一管式操作,熒光 PCR 檢測,不容易產生環境污染。
6.本產品只能用于科研,本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。
【試劑組成】
成分 | 十孔盒包裝 |
2×qPCR MagicMix | 500μL(棕色) |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL(黃蓋) |
HLA-A 基因染料法 qPCR 引物 混合液 | 100 μL(白蓋) |
HLA-A 基因染料法 qPCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 1mL(綠蓋) |
核酸釋放劑試用裝 | 1mL(綠蓋) |
使用手冊 | 1 份 |
【運輸及保存】低溫運輸,-20℃保存,保存期限為 12 個月。
【自備試劑】樣品 RNA。
【注意事項】
一、制備標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原, 本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1.標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
3.在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照(其濃度為 1×10E8 拷貝/μL,試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7.用自選方法純化樣品的 DNA,本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容。
8.如果有 N 個樣品,則需要進行 N+2 個樣品提取,多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。本試劑盒免費贈送1ml免DNA提取的核酸釋放劑試用裝,該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR 模板,省略了 DNA 提取步驟。
三、設置 qPCR 反應(20μL 體系,在樣品制備室進行)
9.如果進行定量分析,則標記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照,6 個用于標準曲線樣品。如果做定性分析,則 6 個標準曲線樣品只選一個做(可以選 4 號,其余樣品不變)。以下只介紹定量分析的反應設置。
10.在標記管中按下表加入各成分:
成分 | N+2 個 樣品管 | PCR 陰性 對照管 | 標準曲線 樣品管(2-7 管) |
2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
HLA-A 基因染料法 qPCR 引物 混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
自備 10×ROX (見注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
N+2 個待測樣品 DNA 模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
自備超純水 | 不加 | 6 μL | 不加 |
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液 (2-7 號) |
不加 |
不加 | 各 6μL(2 號樣到 2 號管,3 號樣到 3號管…) |
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照,其他熒光 PCR 儀器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480) 不需要使用 ROX,則用水替代。
11.蓋上蓋子后上機,按下面參數進行 PCR(具體 PCR 參數可以根據儀器不同而自行優化)。
四、熒光定量 PCR 反應參數
過程 | 溫度 | 時間 |
預熱 | 50℃ | 2 min |
預變性 | 95℃ | 10 min |
PCR 反應 (40 個循環) | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 1 min(采集 SYBR 通道的熒 光信號) | |
按儀器預設程序進行溶解曲線分析 |
五、數據處理
12. 設定 60℃-96℃范圍的融解曲線分析,排除假陽性。
13. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。
14. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 40,則為陽性。